HSP27、E-cadherin及Ki-67在星型膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)及意義

饒翔，楊丞

(1.海口市人民醫(yī)院病理科，海南 海口 570108；2.海南醫(yī)學(xué)院病理教研室，海南 海口 571199)

HSP27、E-cadherin及Ki-67在星型膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)及意義

饒翔1，楊丞2

(1.海口市人民醫(yī)院病理科，海南 海口 570108；2.海南醫(yī)學(xué)院病理教研室，海南 海口 571199)

目的 分析熱休克蛋白27(HSP27)、上皮-鈣黏素(E-cadherin)及Ki-67在星型膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)及意義。方法選取WHO分級(jí)為Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)星型膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤標(biāo)本共40例，采用免疫組化檢測(cè)HSP27、E-cadherin及Ki-67的表達(dá)。結(jié)果HSP27在Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤的表達(dá)(8/13，61.5%)與Ⅲ級(jí)(12/13，92.3%)，Ⅳ級(jí)(14/14，100.0%)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)的表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。87.5%(35/ 40)的膠質(zhì)瘤E-cadherin表達(dá)出現(xiàn)表達(dá)缺失或下降，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但與HSP27的表達(dá)之間存在負(fù)性趨勢(shì)。膠質(zhì)瘤Ki-67指數(shù)隨WHO分級(jí)增高而提高[Ⅱ級(jí)：(2.38±1.39)%、Ⅲ級(jí)：(11.07±9.73)%、Ⅳ級(jí)：(27.31±16.02)%]，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并與HSP27的表達(dá)正相關(guān)(P＜0.05)。結(jié)論Hsp27與Ki-67的表達(dá)對(duì)判斷膠質(zhì)瘤組織學(xué)分級(jí)及增殖活性具有重要意義。E-cadherin表達(dá)下降可能在膠質(zhì)瘤形成早期即出現(xiàn)，可作為星型膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生瘤變的早期判斷指標(biāo)。E-cadherin可能與HSP27共同參與膠質(zhì)瘤的演進(jìn)。

熱休克蛋白27；上皮-鈣黏素；Ki-67；星型膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤

星型膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，根據(jù)WHO分類，主要包括彌漫性星型細(xì)胞瘤、間變性星型細(xì)胞瘤和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。HSP27屬小熱休克蛋白家族成員(Small heat shock protein，sHSP)，在前列腺癌、肝癌、骨肉瘤等多種惡性腫瘤中均檢測(cè)到HSP27的異常表達(dá)，并與患者預(yù)后相關(guān)[1-2]。Shiota等[3]發(fā)現(xiàn)HSP27蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)前列腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)和細(xì)胞周期，可提高癌細(xì)胞的侵襲能力。研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤同樣存在EMT現(xiàn)象[4]。EMT是指腫瘤細(xì)胞失去上皮細(xì)胞極性，獲得較高的侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力。為此本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化檢測(cè)HSP27、E-cadherin和Ki-67蛋白在星型膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)，探討三者在瘤細(xì)胞增殖活性及腫瘤發(fā)展過(guò)程中的生物學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本 40例樣本均來(lái)自海口市人民醫(yī)院病理科診斷為星型膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤病例，根據(jù)WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類，包括彌漫性星型細(xì)胞瘤(WHOⅡ級(jí))13例、間變性星型細(xì)胞瘤(WHOⅢ級(jí))13例和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHOⅣ級(jí))14例；男23例，女17例，患者年齡2～78歲(中位年齡46歲)。所有患者術(shù)前均未行放、化療。對(duì)照組8例，均為癌旁正常膠質(zhì)組織。

1.2 試劑 HSP27(兔抗人多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司)、E-cadherin(鼠抗人單克隆抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Ki-67(鼠抗人單克隆抗體，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；免疫組化MaxVision檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。DAB顯色試劑盒和EDTA修復(fù)液均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 HSP27、E-cadherin及Ki-67免疫組化所用石蠟組織均4 μm切片，HSP27抗體濃度為1:100，其余一抗為即用型。切片脫蠟、水化，3%的H2O2封閉10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗三次后高溫高壓修復(fù)，滴加一抗，室溫孵育1 h；PBS沖洗三次，滴加二抗，室溫下孵育20 min；PBS沖洗三次后，滴加DAB顯色劑，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。實(shí)驗(yàn)按照一抗說(shuō)明書制備陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照用PBS液代替一抗制備。

1.4 結(jié)果判定 HSP27以胞漿或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，在陽(yáng)性區(qū)域隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)百分比，判定標(biāo)準(zhǔn)[5]：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤25%為(-)，26%～50%為(+)，51%～75%為(++)，＞76%為(+++)。E-cadherin以胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性[6]，按陽(yáng)性細(xì)胞所占計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)百分比，判定標(biāo)準(zhǔn)[7]：陽(yáng)性率10%～25%為(+)，26%～50%為(++)，＞50%為(+++)，無(wú)陽(yáng)性或陽(yáng)性細(xì)胞＜10%為(-)。Ki-67表達(dá)于細(xì)胞核，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)百分比，判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞＜1%為0，1%～10%為(+)，10%～20%為(++)，＞20%為(+++)，各組陽(yáng)性率以Ki-67指數(shù)表示(Ki-67指數(shù)=均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異采用交叉表分析及非參數(shù)檢驗(yàn)χ2分析，三者相關(guān)性分析采用非參數(shù)檢驗(yàn)相關(guān)性分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 HSP27在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組中的表達(dá) 本組40例腫瘤中HSP27陽(yáng)性表達(dá)為34例，總陽(yáng)性率85.0%，其中Ⅱ級(jí)為61.5%(8/13)，Ⅲ級(jí)為92.3%(12/ 13)，Ⅳ級(jí)為100.0%(14/14)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，Ⅱ級(jí)與Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤之間的HSP27陽(yáng)性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1和表1。

圖1 HSP27在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)(×100)

表1 HSP27在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組中的表達(dá)(n=40)

2.2 Ki-67在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組中的表達(dá) Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤Ki-67指數(shù)為(2.38±1.39)%，Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤為(11.07±9.73)%，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤為(27.31±16.02)%。采用兩兩比對(duì)分析表明：各級(jí)膠質(zhì)瘤組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。并且HSP27與Ki-67的表達(dá)之間存在正相關(guān)性(P＜0.05)，見表2。

表2 Ki-67在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組中的表達(dá)(n=40)

2.3 E-cadherin蛋白在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組中的表達(dá) 本研究中E-cadherin蛋白總陽(yáng)性率為12.5% (5/40)。各組的表達(dá)率分別為15.4%(2/13)(WHOⅡ級(jí))、7.7%(1/13)(WHOⅢ級(jí))及14.3%(2/14)(WHOⅣ級(jí))，組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖2、表3。

圖2 E-cadherin在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)(×100)

表3 E-cadherin在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組中的表達(dá)(n=40，例)

3 討 論

HSP27又名27KD熱休克蛋白，由定位于7q11.23的HSPB1基因編碼，廣泛表達(dá)在各種細(xì)胞，是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡等多種生物學(xué)功能。在正常細(xì)胞內(nèi)，HSP27因受細(xì)胞周期調(diào)控而維持于低水平，當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)或異常增生時(shí)，其合成增多從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制凋亡。研究證實(shí)，表達(dá)量異常的HSP27蛋白可通過(guò)多種信號(hào)通路或參與腫瘤EMT過(guò)程，促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[8-9]。并且磷酸化修飾后的HSP27可能在IFN-β誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡中起重要調(diào)節(jié)作用[10]。另有研究表明，HSP27與多種腫瘤耐藥相關(guān)，Belkacemi等[11]通過(guò)抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中HSP27轉(zhuǎn)錄后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性增加。而Zhang等[12]也通過(guò)抑制胰腺癌細(xì)胞內(nèi)HSP27的表達(dá)，證實(shí)細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物敏感性增強(qiáng)，同時(shí)使E-cadherin表達(dá)上調(diào)，抑制瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。本研究中Ⅱ級(jí)星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤HSP27陽(yáng)性率為61.5%(8/13)，Ⅲ級(jí)為92.3%(12/13)，Ⅳ級(jí)為100.0%(14/14)，2級(jí)與Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)腫瘤之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。8例腫瘤旁膠質(zhì)細(xì)胞中均無(wú)HSP27表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HSP27的表達(dá)與星型膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤的WHO分級(jí)相關(guān)，這與高級(jí)別膠質(zhì)瘤(Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí))化療耐受的臨床特點(diǎn)一致。提示高表達(dá)的HSP27蛋白在膠質(zhì)瘤演進(jìn)過(guò)程中起到重要作用。Ki-67蛋白反映細(xì)胞增殖活性。Chen等[13]認(rèn)為Ki-67對(duì)于判斷膠質(zhì)瘤患者臨床特征及預(yù)后有重要意義。本研究結(jié)果亦提示隨膠質(zhì)瘤分級(jí)增高，Ki-67表達(dá)陽(yáng)性率亦增高，其表達(dá)在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HSP27與Ki-67表達(dá)水平之間存在正相關(guān)性(P＜0.05)，推測(cè)高表達(dá)的HSP27蛋白可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。證實(shí)HSP27及Ki-67與膠質(zhì)瘤的分化及惡性程度有關(guān)，對(duì)判斷腫瘤分級(jí)有意義。

E-cadherin為細(xì)胞粘附分子，是重要的EMT標(biāo)記物[14]，其表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。研究證實(shí)E-cadherin可在正常膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，但膠質(zhì)瘤中E-cadherin的表達(dá)與腫瘤分級(jí)的相關(guān)性分析在多個(gè)報(bào)道中不盡相同，Bar等[15]在對(duì)92例膠質(zhì)瘤病例的研究中發(fā)現(xiàn)28.8%的膠質(zhì)瘤表達(dá)E-cadherin，與分級(jí)無(wú)相關(guān)性。在本研究中，8例腫瘤旁膠質(zhì)細(xì)胞E-cadherin均表達(dá)，而膠質(zhì)瘤組織表現(xiàn)為E-cadherin的表達(dá)缺失或表達(dá)下降，其總表達(dá)率為12.5%(5/40)，組間表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，因本組膠質(zhì)瘤組織中E-cadherin蛋白表達(dá)陽(yáng)性例數(shù)較少，與HSP27、Ki-67表達(dá)相關(guān)性沒有得到確定的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)論，但存在負(fù)性趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，EMT現(xiàn)象在星型膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤組織中較普遍，E-cadherin的表達(dá)異常可能在腫瘤形成早期即出現(xiàn)，可作為星型膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤發(fā)展早期的參考指標(biāo)，并可能與HSP27蛋白共同參與腫瘤的演進(jìn)。

綜上所述，HSP27作為低分子量熱休克蛋白，參與星型膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤演進(jìn)，與瘤細(xì)胞的增殖活性相關(guān)，在判斷腫瘤惡性程度及腫瘤分級(jí)方面具有重要意義。E-cadherin表達(dá)下調(diào)可作為星型膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤發(fā)展早期的參考指標(biāo)，在腫瘤防治方面具有重要作用，但與高表達(dá)HSP27蛋白之間相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。

[1]Ciocca DR,Calderwood SK.Heat shock proteins in cancer:diagnostic,prognostic,predictive,and treatment implications[J].Cell Stress Chaperones,2005,10(2):86-103.

[2]Wang XW,Shi XH,Tong YS,et al.The prognostic impact of heat shock proteins expression in patients with esophageal cancer:a meta-analysis[J].Yonsei Med J,2015,56(6):1497-1502.

[3]Shiota M,Bishop JL,Nip KM,et al.Hsp27 regulates epithelial mesenchymal transition,metastasis,and circulating tumor cells in prostate cancer[J].Cancer Res,2013,73(10):3109-3119.

[4]Nordfors K,Haapasalo J,M?kel? K,et al.Twist predicts poor outcome of patients with astrocytic glioma[J].J Clin Pathol,2015,68 (11):905-912.

[5]孫春婷,張會(huì)娟.CK34βE12和HSP27在甲狀腺癌中的表達(dá)及其意義[J].天津醫(yī)藥,2009,37(6):453-455.

[6]Lewis-Tuffin LJ,Rodriguez F,Giannini C,et al.Misregulated E-cadherin expression associated with an aggressive brain tumor phenotype[J].PLoS One,2010,5(10):e13665.

[7]熊一峰,艾云志,徐姍,等.Twist和E-cadherin在人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤及其復(fù)發(fā)灶中的表達(dá)及意義[J].廣東醫(yī)學(xué),2014,35(24):3840-3842.

[8]Wei L,Liu TT,Wang HH,et al.Hsp27 participates in the maintenance of breast cancer stem cells through regulation of epithelial-mesenchymal transition and nuclear factor-κB[J].Breast Cancer Res,2011,13(5):R101.

[9]Cordonnier T,Bishop JL,Shiota M,et al.Hsp27 regulates EGF/ β-catenin mediated epithelial to mesenchymal transition in prostate cancer[J].Int J Cancer,2015,136(6):E496-507.

[10]Dedoni S,Olianas MC,Onali P,et al.Interferon-β counter-regulates its own pro-apoptotic action by activating p38 MAPK signalling in human SH-SY5Y neuroblastoma cells[J].Apoptosis,2014,19(10): 1509-1526.

[11]Belkacemi L,Hebb MO.HSP27 knockdown produces synergistic induction of apoptosis by HSP90 and kinase inhibitors in glioblastoma multiforme[J].Anticancer Res,2014,34(9):4915-4927.

[12]Zhang S,Zhang XQ,Huang SL,et al.The effects of HSP27 on gemcitabine-resistant pancreatic cancer cell line through snail[J].Pancreas,2015,44(7):1121-1129.

[13]Chen WJ,He DS,Tang RX,et al.Ki-67 is a valuable prognostic factor in gliomas:evidence from a systematic review and meta-analysis [J].Asian Pac J Cancer Prev,2015,16(2):411-420.

[14]陳曉敏,郭俊明,樂(lè)東海,等.上皮一間質(zhì)轉(zhuǎn)化:腫瘤轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控機(jī)制[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào),2013,35(9):1367-1375.

[15]Bar JK,Zub L,Lis-Nawara A,et al.Expression and Interactions Between Cell Adhesion Molecules CD44v6 and E-Cadherin in Human Gliomas[J].Adv Clin Exp Med,2014,23(5):827-834.

Expression and significance of HSP27,E-cadherin and Ki-67 in astrocytic tumor.

RAO Xiang1,YANG Cheng2. 1.Department of Pathology,Haikou People's Hospital,Haikou 570108,Hainan,CHINA;2.Department of Pathology, Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo discuss the expression and significances of heat-shock protein 27(HSP27),E-cadherin and Ki-67 in astrocytic tumor.MethodsForty samples of astrocytic tumor were diagnosed by the Department of Pathology of Haikou People's Hospital and divided into diffusely astrocytoma(WHO gradeⅡ,13 cases),astrocytoma (WHO gradeⅢ,13 cases)and glioblastoma multiforme(WHO gradeⅣ,14 cases)according to WHO clasification of tumours of the central nervous system.Expression of HSP27,E-cadherin and Ki-67 was detected by immunohistochemistry.ResultsThe positive expression of HSP27 in the gradeⅡ(8/13,61.5%)and gradeⅢ(12/13,92.3%),gradeⅣgliomas(14/14,100.0%)were significantly different(P＜0.05).However,there was no significant difference in the expression of HSP27 between gradeⅢandⅣastrocytoma(P＞0.05).The rate of E-cadherin expression missing or decreased were 87.5%(35/40)in astrocytoma,and there was no significant difference among the three groups(P＞0.05).E-cadherin expression showed negative trend with the expression of HSP27.The Ki-67 index of astrocytoma increased with the increase of WHO grade[gradeⅡ:(238±1.39)%,gradeⅢ:(11.07±973)%,gradeⅣ:(27.31±1.602)%],and the difference between the groups has statistical significance(P＜0.05).Ki-67 index was positively correlated with the expression of HSP27(P＜0.05).ConclusionExpression of HSP27 and Ki-67 is meaningful to evaluate tumor pathologic grading and associated with the biological behavior of astrocytic tumor.Abnormal expression of E-cadherin maybe an early event in the process of tumorigenesis,which can be regarded as an index for early diagnosis.The low expression of E-cadherin and over expression of hsp27 may play an important role in the development of astrocytic tumor.

Heat-shock protein 27(HSP27);E-cadherin;Ki-67;Astrocytic tumor

R730.264

A

1003—6350（2016）10—1579—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.010

2015-11-01)

楊丞。E-mail：yangcheng6@sina.com