舌鱗癌組織中VEGFR-3和淋巴管密度的表達及其臨床病理意義

陳凱，王珂，潘宣，吳妹娟，馬映霞，龔攀

（1.廣東藥學院附屬第一醫院口腔科，廣東 廣州 510080；2.廣州醫科大學附屬腫瘤醫院口腔科，廣東 廣州 510095）

舌鱗癌組織中VEGFR-3和淋巴管密度的表達及其臨床病理意義

陳凱1，王珂1，潘宣1，吳妹娟1，馬映霞1，龔攀2

（1.廣東藥學院附屬第一醫院口腔科，廣東 廣州 510080；2.廣州醫科大學附屬腫瘤醫院口腔科，廣東 廣州 510095）

目的 檢測舌鱗癌組織中血管內皮生長因子受體3(VEGFR-3)和淋巴管密度(LVD)的表達水平，探討其與患者臨床病理指標的關系。方法選取2006年1月至2014年5月搜集的舌鱗癌標本60例和正常舌體標本12例，采用免疫組化染色法檢測組織中VEGFR-3和LVD的表達水平，運用SPSS19.0軟件處理實驗數據，統計分析VEGFR-3與腫瘤LVD之間的相關性及臨床病理意義。結果VEGFR-3在舌鱗癌組織中的高表達率為56.67%，對照組為25.00%；LVD在舌鱗癌組織中的高表達率為58.33%，對照組為16.67%；舌鱗癌中VEGFR-3和LVD的表達明顯高于正常舌組織，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。VEGFR-3和LVD的高表達與淋巴結轉移(PVEGFR-3=0.043，PLVD=0.019)、臨床分期(PVEGFR-3=0.006，PLVD=0.015）及生存狀態(PVEGFR-3=0.028，PLVD=0.015)之間均具有相關性；VEGFR-3和LVD在舌鱗癌中具有正相關性(r=0.916，P＜0.001)。結論VEGFR-3和淋巴管密度與腫瘤的侵襲、轉移及預后密切相關，可作為指導舌鱗癌診治及判斷預后的重要指標。

舌鱗癌；血管內皮生長因子受體3；淋巴管密度；淋巴結轉移

舌癌是最常見的口腔癌，絕大多數為上皮來源的鱗癌，其發病率已呈現上升趨勢，在全身惡性腫瘤中占據第6位[1-2]。由于舌體本身特殊的解剖結構和生理特性，舌鱗癌頸淋巴結轉移率高，局部復發率高，往往危及患者生命；目前以手術為主、放化療為輔的綜合治療方案已普遍運用于舌鱗癌的臨床治療，但舌鱗癌患者的5年總體生存率仍然停留在50%～60%[3-4]。

近年來，研究發現血管內皮生長因子受體3 (Vessel endotheliumgrowth factor receptor 3，VEGFR-3)及腫瘤淋巴管密度(Lymphatic vessel density，LVD)與腫瘤的淋巴結轉移關系密切。本研究通過采用免疫組織化學技術檢測VEGFR-3和淋巴管密度在舌鱗癌組織中的表達情況，進而探討VEGFR-3、淋巴管密度與腫瘤淋巴結轉移等臨床病理參數之間的關系，為探索舌鱗癌淋巴結轉移機制、提高舌鱗癌的治療效果提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 標本 選取廣東藥學院附屬第一醫院口腔科2006年1月至2014年5月病理科收集的舌癌切除及頸淋巴清掃術患者的石蠟包埋標本60例為實驗組；選取正常舌黏膜12例(外傷后手術切除組織)為對照組。所有病例均有完整的臨床資料及隨訪記錄，診斷標準按照2010年國際抗癌協會(UICC)制定的舌鱗癌的TNM分類和臨床分期。

1.2 試劑和方法 所有樣本均經10%福爾馬林液固定，常規石蠟包埋。將實驗石蠟標本進行連續切片，厚為4 μm，免疫組織化學染色法檢測VEGFR-3、LYVE-1的表達，各項步驟均按試劑說明書操作，嚴格控制實驗條件。羊抗人LYVE-1多克隆抗體購自R&D公司；羊抗人VEGFR-3多克隆抗體購自北京中杉生物技術公司；GTVisionTMⅢ抗羊免疫組化檢測試劑盒購自上海基因公司。

1.3 結果判定 (1)VEGFR-3蛋白：VEGFR-3蛋白多表達于胞漿和胞膜中，胞漿和胞膜中有棕黃色顆粒沉著的細胞為陽性細胞。在染色均勻的腫瘤區，選取5個高倍鏡視野(×400)，按照陽性細胞百分比及染色強度進行評估：依據陽性細胞所占比例0，1%～10%，11%～49%，50%～100%，分別計作0、1、2、3分；依據無染色，染色淡黃色、黃色、棕黃色分別計作0、1、2、3分；二者乘積作為總分，0～3分為低表達，4～9分為高表達。(2)淋巴管密度(LVD)：LYVE-1陽性染色為胞漿和胞膜棕黃色染色；在本實驗中具有管腔結構的LYVE-1陽性陽性標記的淋巴管用于LVD的計數。首先在低倍鏡下選擇5個染色清晰、背景對照良好的區域，然后在200倍鏡視野下記錄脈管數目，取其均數作為該樣本的淋巴管密度。根據本研究中LVD表達的具體情況，將LVD位于0～10之間者作為低表達組，而大于10者納入高表達組。

1.4 統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計數資料比較采用χ2檢驗，Spearman等級相關分析腫瘤中VEGFR-3表達與腫瘤淋巴管密度的關系，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 VEGFR-3在正常組織及舌鱗癌中的表達情況 VEGFR-3陽性表達定位于舌鱗癌癌細胞質中，呈棕黃色染色顆粒(見圖1、圖2)。本實驗中，VEGFR-3在舌鱗癌組中高表達34例，低表達26例，高表達率為56.67%，低表達率為43.33%；在對照組中，高表達3例，低表達9例，高表達率為25.00%，而低表達率為75.00%(見圖3)。VEGFR-3在舌鱗癌中的高表達率明顯高于在正常舌組織中的高表達率，差異有統計學意義(χ2=4.01，P=0.045)。

圖2 舌鱗癌組織免疫組化染色VEGFR-3低表達(×400)

圖3 正常舌組織免疫組化染色VEGFR-3低表達(×400)

2.2 LVD在正常組織及舌鱗癌中的表達情況 LYVE-1陽性表達定位于舌鱗癌組織中淋巴管內皮細胞的細胞質或者細胞膜中，呈棕黃色顆粒(見圖4、圖5)。本實驗中，舌鱗癌組織中的淋巴管常由多個小的不成形的管腔構成網狀結構，管腔呈塌陷或擴張狀態。LVD在舌鱗癌組中高表達35例，低表達25例，高表達率為58.33%，低表達率為41.67%；在對照組中高表達2例，低表達10例，高表達率為16.67%，而低表達率為83.33%(見圖6)。舌鱗癌組織中LVD的高表達率明顯高于在正常舌組織中LVD的高表達率，差異有統計學意義(χ2=6.95，P=0.008)。

圖4 舌鱗癌組織免疫組化染色LYVE-1低表達（200×）

圖5 舌鱗癌組織免疫組化染色LYVE-1高表達(200×)

圖6 正常舌組織免疫組化染色LYVE-1低表達(200×)

2.3 VEGFR-3表達、腫瘤LVD與臨床病理參數的關系 VEGFR-3的高表達與淋巴結轉移(P= 0.043)、臨床分期(P=0.006)及生存狀況(P=0.028)之間均具有相關性，而與患者的性別、年齡、腫瘤T分類及分化程度無關；腫瘤LVD的高表達與淋巴結轉移(P= 0.019)、臨床分期(P=0.015)、生存狀態(P=0.015)之間均具有相關性，見表1。而VEGFR-3的高表達與腫瘤LVD的高表達呈正相關，Spearman等級相關系數為0.915(P＜0.01)。

表1 舌鱗癌組織LVD、VEGFR-3表達與患者臨床病理特征的關系[例（%）]

3 討 論

舌癌主要通過淋巴道轉移，淋巴結轉移是舌癌患者最重要的預后指標之一。但長期以來，由于缺乏特異的淋巴管內皮標記物，關于腫瘤淋巴結轉移的具體過程和具體方式一直爭論較多，對腫瘤淋巴轉移的研究也遠遠落后于血管轉移。近年來，一系列淋巴管內皮細胞特異性標記物和淋巴管生成特異性調控因子的相繼發現，極大地加快了對淋巴管生成研究的速度。已有眾多的實驗研究證明，腫瘤組織中的淋巴管生成在腫瘤淋巴結轉移過程中起著重要的作用[5-7]。淋巴管為腫瘤細胞的浸潤和轉移提供了直接通道，并與患者不良預后有關[8]。Liang等[9]在對直腸癌進行研究后發現：同無淋巴管浸潤的腫瘤相比，在有淋巴管浸潤現象的腫瘤中，其LVD明顯增高，且瘤體的LVD與結直腸癌的轉移呈正相關。蘇震等[10]通過對膀胱癌的觀察發現，腫瘤組織LVD明顯高于正常組織，淋巴結轉移組LVD高于無淋巴結轉移組，浸潤超過肌層組LVD高于浸潤未超過肌層組。實驗還得出結論：在膀胱癌的發生發展過程中，LVD的升高是一個不良信號，即正常組織在惡變的過程中淋巴管的生成加快，進而加速了組織的惡變進程，淋巴管生成與膀胱癌的形成及其侵襲轉移密切相關。在本實驗中，我們發現舌鱗癌組織中LVD的高表達率明顯高于正常舌組織，而且腫瘤LVD的高表達與舌鱗癌的淋巴結轉移、臨床分期及患者的生存狀態均具有相關性，這和上述學者的研究結果基本一致。

VEGFR-3是一種酪氨酸激酶受體，結構上由胞外區、跨膜區及胞內區組成。在正常的成人個體中，VEGFR-3幾乎只特異性地表達在淋巴管內皮細胞上。VEGFR-3與VEGF-C/D結合后發揮其生物學效應：誘導脈管內皮細胞的增殖和遷移，調控淋巴管的生成，進而調控腫瘤的生長轉移。目前大多數學者都認為，VEGF-C/D-VEGFR-3機制調控著淋巴管內皮細胞的增殖和淋巴管的生成[11]。Stearns等[12]研究發現在有前哨淋巴結參與的原發性腫瘤中，VEGFR-3的表達水平明顯提高，通過抑制VEGFR-3的表達可能對阻斷腫瘤的淋巴結轉移具有重要的意義。盧壁輝等[13]通過對結腸癌的研究發現VEGFR-3在腫瘤組織中的表達顯著增高，而且VEGFR-3的高表達與腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移具有相關性。在本實驗中，我們發現VEGFR-3在舌鱗癌組織中的高表達顯著高于正常組織，VEGFR-3的高表達與舌鱗癌的淋巴結轉移明、臨床分期及生存狀況具有明顯相關性；我們還發現VEGFR-3的高表達與腫瘤LVD存在正相關性。考慮VEGFR-3表達水平增高并與VEGF-C/D結合后，刺激新生淋巴管生成、改善管腔通透性及內外壓力差，促進腫瘤細胞經淋巴管向遠處轉移。

VEGFR-3和LVD在舌鱗癌的發展過程中起著重要作用，二者的聯合檢測可以作為預測舌鱗癌淋巴結轉移和指導臨床診治的重要指標。

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[13]盧壁輝,黃壯生.MMP-7、VEGF-C和VEGFR-3在結腸癌組織中的表達及相關性[J].廣東醫學,2015,36(6):878-880.

Expression of VEGFR-3 and LVD in tongue squamous cell carcinoma and their clinical pathological significance.

CHEN Kai1,WANG Ke1,PAN Xuan1,WU Mei-juan1,MA Ying-xia1,GONG Pan2.1.Department of Stomatology,the First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510080,Guangdong,CHINA;2.Department of Stomatology,the Cancer Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510095,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate vascular endothelial growth factor receptor-3(VEGFR-3)and lymphatic vessel density(LVD)relationships with clinical pathological indicators through studying their expression in tongue squamous cell carcinoma.MethodsSixty cases of tongue squamous cell carcinoma(TSCC)and 12 cases of normal tongue were collected from January 2006 to May 2014,and the expression of VEGFR-3 and LVD in these cases were detected by immunohistochemical staining.SSPS19.0 software was used to process the experimental data and analyze the correlation between VEGFR-3 and LVD,and their clinical pathological significance.ResultsThe expression rate of VEGFR-3 in TSCC and normal tongue were respectively 56.67%and 25.00%(P=0.045).The expression rate of LVD in TSCC and normal tongue were respectively 58.33%and 16.67%(P=0.008).The expression of VEGFR-3 and LVD in TSCC were significantly higher than in normal tongue(P＜0.05).The expression of VEGFR-3 and LVD were significantly associated with lymph node metastasis(PVEGFR-3=0.043,PLVD=0.019),clinical stage(PVEGFR-3=0.006,PLVD=0.015)and living conditions(PVEGFR-3=0.028,PLVD=0.015).The expression of VEGFR-3 had a positive correlation with the expression of LVD(r=0.916,P＜0.001).ConclusionVEGFR-3 and LVD are closely correlated to invasion,metastasis and prognosis of TSCC.So they can be the important indicators for guiding the diagnosis and treatment,and judging the prognosis of TSCC.

Tongue squamous cell carcinoma(TSCC);Vascular endothelial growth factor receptor-3(VEGFR-3);Lymphatic vessel density(LVD);Lymph node metastasis

R739.86

A

1003—6350（2016）10—1575—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.009

2015-12-15)

廣東省醫學科研基金指令性課題項目(編號：C2015031)；廣東藥學院附屬第一醫院院內課題項目（編號：201218）；廣州醫科大學青年科研項目(編號：2014A37)

潘宣。E-mail：603200275@qq.com