海南三叉苦抗炎作用及機制研究

林紫微，趙智萍，林志軍，王海龍，任守忠，李佩佩

（海南醫學院藥學院，海南海口571199）

海南三叉苦抗炎作用及機制研究

林紫微，趙智萍，林志軍，王海龍，任守忠，李佩佩

（海南醫學院藥學院，海南海口571199）

目的研究海南三叉苦水提物的抗炎作用并探索其作用機制。方法通過二甲苯致小鼠耳腫脹、角叉菜膠致大鼠足腫脹來觀察三叉苦的抗炎作用。采用酶聯免疫吸附法(ELΙSA法)測定腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素1β(ΙL-1β)的含量。結果與模型組(0)相比，三叉苦水提物中、高劑量(19.11%，22.94%)能抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹(P＜0.05)，中劑量對角叉菜膠致大鼠足腫脹有明顯的抑制作用，在致炎4 h[(0.53±0.17)cm]效果最明顯(P＜0.01)。水提物中、高劑量對大鼠血清中TNF-α[(169.61±73.80)ng/L和(124.34±85.65)ng/L]和ΙL-1β [(521.01±206.89)ng/L和(393.99±197.61)ng/L]有不同程度的降低作用，TNF-α較模型組[(283.98±68.68)ng/L]降低顯著(P＜0.05)。結論海南三叉苦水提物具有抗炎作用，其抗炎作用可能與抑制TNF-α和ΙL-1β的生成有關。

三叉苦；抗炎；作用機制；腫瘤壞死因子α；白細胞介素1β

三叉苦為蕓香科吳茱萸屬植物三叉苦[Evodia lepta(Spreng.)Merr]的干燥全株，又名三椏苦、小黃散、雞骨樹、三丫苦、三枝槍、三叉虎等，味苦，性寒，具有清熱解毒、祛風除濕、消腫止痛等功效；主治咽喉腫痛、瘧疾、黃疸型肝炎、風濕骨痛、濕疹皮炎、感冒發熱、扁桃體炎、咽喉炎、跌打腫痛、風濕痹痛等[1-3]。由三叉苦等組成的貫黃感冒沖劑等復方具有清熱解毒、祛風止咳作用，用于感冒、發熱、咳嗽等風熱型感冒，在市場上具有較好的聲譽。本實驗通過研究海南三叉苦對兩種急性炎癥模型的保護作用，比較海南三叉苦水提物對正常和炎癥模型大鼠血清中的TNF-α和ΙL-1β含量的影響，進一步探討其抗炎作用機制，以便為開發海南三叉苦的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物50只健康昆明種小鼠和48只健康昆明種大鼠，購于長沙市天勤生物科技有限公司。

1.2 儀器TP-1200C公斤電子天平(湘儀天平儀器設備有限公司)；SENCO R系列旋轉蒸發器(上海申生科技有限公司)；SENCO W201恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；HH-6數顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)；MK3酶標儀(美國Thermo)。

1.3 藥材與試劑三叉苦采于海南省瓊海市長坡鎮，經海南醫學院曾念開老師鑒定為蕓香科吳茱萸屬植物三叉苦的干燥莖葉；阿司匹林腸溶片(批號：150116222，辰欣藥業股份有限公司)；布洛芬緩釋膠囊(批號：20150505，長春海外制藥集團有限公司)；二甲苯(批號：20140919，廣州光華科技股份有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 海南三叉苦水提物樣品制備水煎煮法制備，稱取三叉苦干燥莖葉共2 000 g，浸泡過夜，煎煮3次。第一次10倍量水煎煮2 h，第二次9倍量水煎煮1.5 h，第三次8倍量水煎煮1 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至稠膏，50℃下真空干燥，計算提取率。實驗時用蒸餾水溶解至所需濃度。

1.4.2 海南三叉苦水提物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響[4]取小鼠50只，稱重，標號，按體重隨機分為5組，即模型組、阿司匹林組、三叉苦水提物低、中、高劑量組，每組10只。灌胃給藥，連續給藥5 d，1次/d，灌胃體積為0.1 mL/10 g體重，模型組給予等體積的蒸餾水。末次給藥后1 h，在每只小鼠右耳前后兩面涂二甲苯各20μL，左耳不涂作為對照，45 min后脫頸處死，剪下完整左右耳，用6 mm直徑打孔器在距耳緣1 cm處打下圓耳片，稱重。左右耳的重量之差作為腫脹度并計算腫脹抑制率，計算公式為：腫脹度=右耳重量-左耳重量，腫脹抑制率=(模型組腫脹度－藥物組腫脹度)/模型組腫脹度×100%。

1.4.3 海南三叉苦水提物對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響[5]取大鼠42只，按1.4.1方法分為6組，即空白組、模型組、布洛芬組、三叉苦水提物低、中、高劑量組，每組8只。灌胃給藥，連續5 d，1次/d，灌胃體積為1 mL/100 g體重，空白組和模型組給予等體積蒸餾水。末次給藥后，測量每只大鼠右后足踝關節周長(cm)，1 h后，除空白組以外，每組大鼠均在右后足足趾中部皮下注射1%角叉菜膠0.1 mL/只致炎。分別在致炎后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h測定大鼠右后足踝關節周長，計算足趾腫脹度，即足趾腫脹度=致炎后踝關節周長-致炎前踝關節周長。致炎后6 h，乙醚麻醉，斷頭取血，備用。

1.4.4 大鼠血清中TNF-α和ΙL-1β的含量取1.4.3法中大鼠斷頭所得全血，于3 600 r/min下離心，吸取上清液即得到血清。用酶聯免疫吸除法(ELΙSA)，嚴格按照試劑盒說明書操作，測定大鼠血清中TNF-α和ΙL-1β的含量。

1.5 統計學方法采用SPSS16.0軟件進行分析，計量數據用均數±標準差(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，顯著性水平α界定值設定為0.05。以P＜0.05為差異具有統計學的意義。

2 結果

2.1 海南三叉苦水提物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響與模型組比較，三叉苦水提物中、高劑量組對二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制較明顯，差異具有統計學意義(P＜0.05)，而三叉苦水提物低劑量組差異無統計學意義。三叉苦不同劑量組之間有一定的量效關系，高、中劑量組與低劑量組之間有明顯的量效關系，而中、高劑量組之間的量效關系不明顯，見表1。

表1 海南三叉苦水提物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(±s)

表1 海南三叉苦水提物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(±s)

注：與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01。

組別劑量(g/kg)耳腫脹度(mg)腫脹抑制率(%)模型組阿司匹林組三叉苦-0.5 18 6 2 4.97±0.59 3.03±1.39b3.83±1.39a4.02±0.94a4.38±0.59 0 39.64 22.94 19.11 11.87

2.2 海南三叉苦水提物對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響由表2可知，與模型組比較，致炎后1 h、2 h、4 h、5 h、6 h，三叉苦中劑量組的大鼠足腫脹度顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)；致炎后4 h、5 h，高劑量組足腫脹度顯著降低，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)；致炎后4 h，低劑量組足腫脹度降低顯著，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

表2 海南三叉苦水提物對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響(±s)

表2 海南三叉苦水提物對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響(±s)

注：與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01。

組別劑量（g/kg）足腫脹度(cm)模型組布洛芬組三叉苦-0.09 13.5 4.5 1.5 1 h 0.50±0.34 0.23±0.14 0.40±0.35 0.16±0.16a0.39±0.26 2 h 0.86±0.55 0.33±0.14a0.71±0.39 0.44±0.25a0.90±0.33 3 h 0.99±0.35 0.46±0.22b0.63±0.45 0.67±0.21 0.75±0.19 4 h 1.10±0.27 0.37±0.23b0.59±0.37a0.53±0.17b0.78±0.19a5 h 0.93±0.17 0.34±0.22b0.51±0.34a0.46±0.34b0.69±0.15 6 h 0.89±0.38 0.33±0.15b0.63±0.21 0.39±0.27a0.59±0.24

2.3 大鼠血清中TNF-α和ΙL-1β的含量三叉苦水提物中、高劑量組均能降低TNF-α的含量，且與模型組比較，差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)；三叉苦水提物各劑量組能不同程度地降低ΙL-1β的含量，但差異無統計學意義，見表3。

表3 海南三叉苦水提物對角叉菜膠所致足腫脹大鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的影響(±s)

表3 海南三叉苦水提物對角叉菜膠所致足腫脹大鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的影響(±s)

注：與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01。

組別空白組模型組布洛芬組三叉苦劑量(g/kg) --0.09 13.5 4.5 1.5 TNF-α(ng/L) 133.97±51.64b283.98±68.68 198.26±66.51a124.34±85.65b169.61±73.80a211.78±43.33 ΙL-1β(ng/L) 383.39±232.27a565.88±202.14 562.84±214.19 393.99±197.61 521.01±206.89 571.97±223.47

3 討論

本實驗通過復制二甲苯致小鼠耳腫脹、角叉菜膠致大鼠足腫脹兩種急性炎癥模型，觀察三叉苦水提物抗炎效果。結果表明，三叉苦水提物對角叉菜膠致大鼠足腫脹有抑制作用，且三叉苦水提物中劑量組對足腫脹的抑制效果明顯。可見海南三叉苦水提物有明顯的抗炎作用。

炎癥過程中釋放的炎性介質是造成機體損害的重要原因，TNF-α是炎性細胞因子，參與全身炎癥反應，是一種內源性致熱源，能夠引起發燒，誘導細胞凋亡，TNF-α與內皮細胞結合可增加過氧化物陰離子產生，刺激細胞脫顆粒和髓過氧化物酶，從而使內皮細胞分泌ΙL-8、ΙL-1和GM-CSF等炎性因子增加，并促進中性粒細胞在內皮細胞上黏附，進而刺激機體局部發生炎癥反應，是一個重要的炎癥介質[6]。ΙL-1β是由活化的單核巨噬細胞產生的炎性因子，能調節炎癥反應中纖維蛋白的沉積和溶解，促進成纖維細胞膠原酶的產生，刺激成纖維細胞增殖，促進膠原沉積，參與機體的炎癥反應過程[7]。三叉苦水提物給藥組大鼠血清中TNF-α和ΙL-1β的含量與模型組比較有不同程度的降低，其中TNF-α下降明顯，差異有統計學意義，ΙL-1β雖有一定程度降低，但差異無統計學意義，提示抑制TNF-α和ΙL-1β的生成可能是三叉苦抗炎的作用機制。且其抑制作用具有明顯的量效關系，在一定的范圍內，TNF-α和ΙL-1β的含量隨著給藥劑量的增加而顯著降低。

從小鼠耳腫脹實驗結果來看，海南三叉苦水提物的抗炎效果次于阿司匹林；從大鼠足腫脹以及血清中TNF-α、ΙL-1β的測定實驗結果來看，海南三叉苦水提物的抗炎效果優于布洛芬。由此可見，海南三叉苦具有良好的抗炎作用。據調查，一些海南人民會用三叉苦葉子泡茶，有藥食同源之功。因此，海南三叉苦具有很高的藥用商品化價值，可以被進一步的開發利用。

[1]國家中醫藥管理局編委會.中華本草:第二十九卷第四分冊[M].上海:上海科學技術出版社,1999:915.

[2]江蘇新醫學院.中藥大辭典[M].上海:上海科學技術出版社,2003: 68.

[3]中醫學編輯委員會.中國醫學百科全書:中醫學中冊[M].上海:上海科學技術出版社,1991:1030.

[4]徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學[M].北京:人民衛生出版社,1992:719．

[5]徐叔云.藥理實驗方法學[M].3版.北京:人民衛生出版社,2002: 882.

[6]趙瑋,徐景杰.腫瘤壞死因子-α在炎癥與腫瘤中的作用[J].中國療養醫學,2012,21(7):607-609.

[7]俞浩,方艷夕,毛斌斌,等.地榆炮制前后水提物抗炎效果研究[J].中藥材,2014,37(1):34-37.

Anti-inflammatory effect and mechanism of Evodia lepta in Hainan.

LIN Zi-wei,ZHAO Zhi-ping,LIN Zhi-jun,WANG Hai-long,REN Shou-zhong,LI Pei-pei.School of Pharmacy,Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study the anti-inflammatory effect and mechanism of Evodia lepta in Hainan. MethodsThe anti-inflammatory effect of Evodia lepta was observed by acute inflammation model of the mouse ear swelling and rat foot swelling.The contents of tumor necrosis factor alpha(TNF-α)and interleukin 1 beta(ΙL-1β) were determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELΙSA).ResultsCompared with the model group,the middle and high dose water extracts(19.11%,22.94%,respectively)of Evodia lepta could inhibit the ear swelling induced by xylene(P＜0.05);The water extracts at middle doses could remarkably restrained paw edema induced by carrageen,with the best anti-inflammatory effect at 4 h[(0.53±0.17)cm,P＜0.01];The water extracts at middle and high dose could reduce the content of TNF-α[(169.61±73.80)ng/L vs(124.34±85.65)ng/L]and ΙL-1β[(521.01±206.89) ng/L vs(393.99±197.61)ng/L]in rat serum;Compared with the model group[(283.98±68.68)ng/L],the TNF-α was decreased significantly(P＜0.05).ConclusionThe water extract of Evodia lepta has anti-inflammatory effect,and its anti-inflammatory effect may be related to inhibiting the formation of TNF-α and ΙL-1β.

Evodia lepta(Spreng.)Merr.;Anti-inflammatory;Mechanism;Tumor necrosis factor alpha (TNF-α);Ιnterleukin 1 beta(ΙL-1β)

R285.1

A

1003—6350（2016）13—2079—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.13.005

2016-02-25)

2014年省級大學生創新創業訓練計劃項目（編號：20140112）

任守忠。E-mail：540877323@qq.com