番石榴葉總?cè)聘纳?T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗*

李秀存，　馬錦錦，　趙晶晶，　葉開和，　呂艷青，　王小康，　魏崧丞，　張曉琦，　葉春玲△

(1暨南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 廣州 510632；2廣東省婦幼保健院藥學(xué)部，廣東 廣州 511400；3暨南大學(xué)中藥與天然藥物研究所，廣東 廣州 510632)

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番石榴葉總?cè)聘纳?T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗*

李秀存1，馬錦錦1，趙晶晶2，葉開和1，呂艷青1，王小康1，魏崧丞1，張曉琦3，葉春玲1△

(1暨南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 廣州 510632；2廣東省婦幼保健院藥學(xué)部，廣東 廣州 511400；3暨南大學(xué)中藥與天然藥物研究所，廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 觀察番石榴葉總?cè)?TTPGL)對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗(IR)的改善作用，并探討其可能的作用機(jī)制。方法: 培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化，給予TTPGL(0.3、1、3、10 μg/L)，并設(shè)溶媒(0.1% DMSO)組、陽性藥正釩酸鈉(Van，10 μmol/L)組、正常對(duì)照(control)組和模型(model)組，藥物作用48 h。MTT法檢測(cè)藥物對(duì)前脂肪細(xì)胞活力的影響，油紅O染色法觀察其對(duì)細(xì)胞分化的影響。建立IR模型后,藥物處理48 h，葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法(GOD-POD)檢測(cè)IR脂肪細(xì)胞上清液中葡萄糖消耗量；比色法檢測(cè)游離脂肪酸(FFA)水平；ELISA法檢測(cè)脂肪因子分泌水平；real-time PCR檢測(cè)IR脂肪細(xì)胞蛋白酪氨酸激酶1B(PTP1B)的mRNA表達(dá)量；Western blot檢測(cè)磷酸化胰島素受體底物1/胰島素受體底物1(p-IRS-1/IRS-1)和磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B(p-Akt/Akt)的蛋白水平。結(jié)果: 與溶媒組比較，TTPGL顯著提高了前脂肪細(xì)胞的活力并抑制其分化(P<0.01)。與IR溶媒組比較，無論在基礎(chǔ)狀態(tài)下還是胰島素刺激狀態(tài)下，TTPGL(1-10 μg/L)均顯著地促進(jìn)了IR脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗(P<0.01)；TTPGL(0.3～3 μg/L)顯著抑制FFA的產(chǎn)生(P<0.01)。與模型組比較，TTPGL(0.3和3 μg/L)顯著增加IR脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的分泌(P<0.05)并抑制TNF-α的分泌(P<0.01)，TTPGL(3 μg/L)對(duì)抵抗素的分泌有顯著抑制作用(P<0.05)，對(duì)瘦素分泌無顯著作用；TTPGL(3 μg/L)顯著下調(diào)IR脂肪細(xì)胞PTP1B的mRNA表達(dá)(P<0.01)；TTPGL(3 μg/L)極顯著上調(diào)p-IRS-1/IRS-1的水平；TTPGL(0.3和3 μg/L)顯著上調(diào)p-Akt/Akt的蛋白水平(P<0.05)。結(jié)論: TTPGL具有顯著改善3T3-L1脂肪細(xì)胞IR的作用，其作用機(jī)制可能與TTPGL下調(diào)了IR脂肪細(xì)胞PTP1B mRNA的表達(dá)、同時(shí)上調(diào)p-IRS-1/IRS-1和p-Akt/Akt的蛋白水平有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]番石榴葉總?cè)? 胰島素抵抗; 蛋白酪氨激酶1B； 胰島素受體底物1； 蛋白激酶B

糖尿病(diabetes mellitus，DM)及其慢性并發(fā)癥已成為繼腫瘤和心腦血管疾病后人類的第3大死亡原因[1]。預(yù)計(jì)到2025年，全球糖尿病患者將高達(dá)3.8億，其中90%以上為2型糖尿病患者。2型糖尿病的主要病理生理基礎(chǔ)是胰島素抵抗(insulin resis-tance，IR)伴或不伴胰島素分泌相對(duì)不足[2]，它貫穿于2型糖尿病發(fā)展的整個(gè)過程。

番石榴為桃金娘科番石榴屬植物，主要生長(zhǎng)在東南亞的熱帶地區(qū)。其主要成分包括黃酮類化合物、萜類化合物以及酚酸化合物，研究表明這些化合物具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗糖尿病等作用[3]。在前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，本課題組首次發(fā)現(xiàn)番石榴葉總?cè)?total triterpenoids fromPsidiumguajavaleaf，TTPGL)可有效改善由高脂飲食和小劑量鏈脲佐菌素共同誘發(fā)的2型糖尿病大鼠IR的作用。本課題采用3T3-L1脂肪細(xì)胞建立胰島素抵抗模型，繼續(xù)探討TTPGL對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞IR的改善作用，并通過觀察TTPGL對(duì)IR脂肪細(xì)胞蛋白酪氨酸激酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)的mRNA的表達(dá)以及對(duì)胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1 IRS-1)、蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)磷酸化的影響，揭示其改善胰島素抵抗的作用機(jī)制。

材料和方法

1材料

1.1樣本與試劑3T3-L1前脂肪細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；番石榴葉總?cè)朴婶吣洗髮W(xué)中藥與天然藥物化學(xué)研究所張曉琦教授提供，其分子結(jié)構(gòu)式見圖1；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco。MTT購(gòu)自Amresco；地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、油紅O和DMSO購(gòu)自Sigma；正釩酸鈉(sodium orthovanadate,Van)購(gòu)自阿拉丁公司；無水乙醇、異丙醇、多聚甲醛和冰乙酸購(gòu)自天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；TRIzol購(gòu)自Invitrogen；DNA引物委托上海捷瑞生物工程有限公司合成；ReverTra Ace qPCR RT Kit和SsoFast EvaGreen Supermix qPCR Kit購(gòu)自TOYOBO；抗GAPDH、 IRS-1、 p-Akt (Ser473)和Akt的抗體購(gòu)自CST；抗p-IRS-1 (Tyr632)的抗體購(gòu)自Abcam。

Figure 1.Chemical structural formula of TTPGL

圖1番石榴葉總?cè)频幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式

1.2主要儀器ELX800多功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek)；BR4i低溫高速離心機(jī)(Thermo)；TS100倒置顯微鏡(Nikon)；DK-S22電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；79-1磁力加熱攪拌器(北京六一儀器廠)；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)；PTC-1152 PCR儀(Bio-Rad)；SMYUV-750紫外分光光度計(jì)(上?？等A生化儀器制造廠)；Trans-Blot Turbo蛋白電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad)；ImageQuant LAS 4000凝膠成像系統(tǒng)(GE Healthcare)。

2方法

2.13T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)條件為10% 胎牛血清+100 U雙抗的高糖DMEM完全培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合后，首先加入誘導(dǎo)液1(0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L DEX和10 mg/L insulin)，作用48 h后，換成誘導(dǎo)液2(10 mg/L insulin)，作用48 h后，將誘導(dǎo)液換為含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)誘導(dǎo)分化，直至80%以上的細(xì)胞分化成熟。

2.2MTT法測(cè)定3T3-L1前脂肪細(xì)胞的活力取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的前脂肪細(xì)胞，離心后重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至3×107/L，接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后分組給藥，分為空白對(duì)照組、溶媒(0.1% DMSO)對(duì)照組、陽性藥Van(10 μmol/L)組和藥物番石榴葉總?cè)?0.3、1、3、10 μg/L)組。給藥處理48 h，加入5 g/L MTT 20 μL，于CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，移除上清液，加入150 μL DMSO，于搖床混勻10 min，酶標(biāo)儀上于測(cè)定波長(zhǎng)570 nm、參比波長(zhǎng)630 nm測(cè)吸光度(A)值。細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值)/空白對(duì)照組A值×100%。

2.3油紅O染色法觀察3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化在細(xì)胞誘導(dǎo)分化8 d后，首先用PBS洗3次，10%多聚甲醛固定10 min，PBS洗后控干，油紅O溶液染色30 min，再用PBS洗3次，于顯微鏡下觀察到細(xì)胞漿內(nèi)被染成紅色的環(huán)狀脂滴。用150 μL異丙醇萃取油紅，酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。細(xì)胞分化率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值)/空白對(duì)照組A值×100%。

2.43T3-L1胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型的建立取分化成熟的脂肪細(xì)胞，分為模型(model)組和正常對(duì)照(control)組，control組給予常規(guī)高糖DMEM完全培養(yǎng)基，model組給予1 μmol/L地塞米松作用96 h用于造模，4 d后提取細(xì)胞上清液，采用GOD-POD法檢測(cè)葡萄糖消耗確定是否造模成功。取造模成功的細(xì)胞用于糖脂代謝實(shí)驗(yàn)。

2.5葡萄糖消耗、游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)產(chǎn)生及脂肪因子分泌的檢測(cè)取造模成功的細(xì)胞分組給藥，分為control組、model組、Van(10 μmol/L)組和TTPGL(0.3、1、3、10 μg/L)組。各組藥物作用48 h后提取細(xì)胞上清液，GOD-POD法檢測(cè)葡萄糖消耗，比色法檢測(cè)FFA產(chǎn)生，ELISA法測(cè)定脂聯(lián)素、瘦素、TNF-α、抵抗素的分泌水平。

2.6real-time PCR檢測(cè)IR脂肪細(xì)胞PTP1B mRNA的表達(dá)6孔板培養(yǎng)細(xì)胞并造模，取造模成功的細(xì)胞分組給藥(分組同2.5)，每組2個(gè)復(fù)孔。各組藥物作用48 h后，棄上清，PBS洗，TRIzol法提各孔總RNA，real-time PCR檢測(cè)PTP1B mRNA的表達(dá)。

2.7Western blot檢測(cè)IR脂肪細(xì)胞p-IRS-1/IRS-1和p-Akt/Akt的蛋白水平6孔板培養(yǎng)細(xì)胞并造模，取造模成功的細(xì)胞分組給藥(分組同2.5)，每組3個(gè)復(fù)孔。各組藥物作用48 h后，棄上清，PBS洗，加入蛋白裂解液(RAPI:PMSF=100：1)于冰上靜置30 min，提取蛋白，Western blot檢測(cè)IRS-1、p-IRS-1、Akt、p-Akt的蛋白水平。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，單因素方差分析后，均數(shù)間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1TTPGL對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞活力的影響

與溶媒組比較，陽性藥Van顯著提高了前脂肪細(xì)胞的活力(P<0.01)；TTPGL(3和10 μg/L)顯著提高前脂肪細(xì)胞活力(P<0.01)，并且TTPGL的作用呈劑量依賴性。TTPGL提高前脂肪細(xì)胞活力的能力顯著低于Van(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The effect of TTPGL on the cell proliferation of 3T3-L1 preadipocytes. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsDMSO group;##P<0.01vsVan group.

圖2番石榴葉總?cè)茖?duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響

23T3-L1前脂肪細(xì)胞分化前后形態(tài)的變化

圖3所示為3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化前后的形態(tài)變化，在顯微鏡下可觀察到分化前為成纖維細(xì)胞，呈梭形；待細(xì)胞分化成熟后細(xì)胞變圓，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量呈指環(huán)狀分布的紅色脂滴，提示細(xì)胞分化成熟。

3TTPGL對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響

與溶媒對(duì)照組比較，陽性藥Van顯著抑制了前脂肪細(xì)胞的分化(P<0.01)；TTPGL(1、3、10 μg/L)呈劑量依賴性抑制其分化(P<0.05)。與Van組比較，TTPGL(1、3 μg/L)抑制前脂肪細(xì)胞分化的能力明顯偏低(P<0.05),而10 μg/L的TTPGL對(duì)前脂肪細(xì)胞分化的抑制能力和Van無顯著性差異，見圖4。

Figure 3.Comparison of 3T3-L1 adipocyte morphology before and after differentiation (×100). A: 3T3-L1 preadipocytes before differentiation; B: 3T3-L1 adipocytes after differentiation.

圖3誘導(dǎo)分化前后3T3-L1脂肪細(xì)胞形態(tài)的對(duì)比

Figure 4.The effect of TTPGL on differentiation of 3T3-L1 preadipocytes. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsDMSO group;#P<0.05,##P<0.01vsVan group.

圖4番石榴葉總?cè)茖?duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響

4TTPGL對(duì)3T3-L1胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗的影響

無論基礎(chǔ)狀態(tài)下還是胰島素刺激狀態(tài)下孵育48 h后，與control比較，model溶媒組細(xì)胞上清液中的葡萄糖含量明顯降低(P<0.01)，提示造模成功。與model組比較，陽性藥Van顯著促進(jìn)IR脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗(P<0.01)；1、3和10 μg/L TTPGL劑量依賴性促進(jìn)其葡萄糖消耗(P<0.05)見圖5。

5TTPGL對(duì)IR脂肪細(xì)胞FFA產(chǎn)生的影響

與control組比較，model組的FFA水平明顯升高(P<0.01)；與model組比較，陽性藥Van顯著抑制了IR脂肪細(xì)胞FFA的產(chǎn)生(P<0.01)；TTPGL在較低濃度下(0.3、1和3 μg/L)顯著抑制FFA的產(chǎn)生(P<0.01)，而10 μg/L TTPGL卻不能抑制IR脂肪細(xì)胞FFA的產(chǎn)生，見圖6。

6TTPGL對(duì)IR脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素、瘦素、TNF-α和抵抗素分泌的影響

模型組與control組比較，差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)；其它各組與模型組比較，可見Van顯著促進(jìn)IR脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的分泌(P<0.01)，顯著抑制TNF-α與抵抗素的分泌(P<0.01)，對(duì)瘦素分泌無顯著作用；TTPGL(0.3和3 μg/L)顯著促進(jìn)了IR脂肪細(xì)胞的脂聯(lián)素分泌P<0.05)，顯著抑制TNF-α的分泌(P<0.01)，在3 μg/L濃度下顯著抑制抵抗素的分泌(P<0.05)。對(duì)瘦素的分泌無明顯作用。對(duì)瘦素和TNF-α的影響，TTPGL和Van無顯著性差異。對(duì)脂聯(lián)素和抵抗素的影響，TTPGL的作用明顯小于Van(P<0.05),見圖7。

Figure 5.The effects of TTPGL on basal and insulin-stimulated glucose consumption in IR adipocytes. Mean±SD.n=6.▲▲P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsmodel group.

圖5番石榴葉總?cè)茖?duì)IR脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗的影響

Figure 6.The effect of TTPGL on the production of FFA in IR adipocytes. Mean±SD.n=6.▲▲P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsmodel.

圖6番石榴葉總?cè)茖?duì)胰IR脂肪細(xì)胞FFA產(chǎn)生的影響

7TTPGL對(duì)IR脂肪細(xì)胞PTP1B mRNA表達(dá)的影響

與模型組比較，陽性藥Van顯著下調(diào)了IR脂肪細(xì)胞PTP1B 的mRNA表達(dá)(P<0.01)；TTPGL僅在3 μg/L濃度下顯著下調(diào)PTP1B的mRNA表達(dá)(P<0.01)，見圖8。

8TTPGL對(duì)IR脂肪細(xì)胞p-IRS-1/IRS-1和p-Akt/Akt水平的影響

與模型組比較，陽性藥Van顯著增加了IR脂肪細(xì)胞p-IRS-1/IRS-1與p-Akt/Akt的水平 (P<0.01)；

Figure 7.The effects of TTPGL on the level of adipocytokines in IR adipocytes. Mean±SD.n=6.▲▲P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.#P<0.05,##P<0.01vsVan group.

圖7番石榴葉總?cè)茖?duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞脂肪因子分泌的影響

Figure 8.The effects of TTPGL on the mRNA expression of PTP1B in IR adipocytes. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsmodel group.

圖8番石榴葉總?cè)茖?duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞PTP1B mRNA表達(dá)的影響

3 μg/L TTPGL顯著增加了p-IRS-1/IRS-1 的水平(P<0.01)；TTPGL(0.3和3 μg/L)顯著增加p-Akt/Akt 水平(P<0.01)。TTPGL在3 μg/L劑量下對(duì)p-IRS-1/IRS-1和p-Akt/Akt的影響與Van比較沒有顯著性差異。在0.3 μg/L劑量下對(duì)p-Akt/Akt的作用明顯低于Van(P<0.01),見圖9。

討論

隨著人們生活水平的提高，肥胖人數(shù)比例逐年增加，糖尿病與之密切相關(guān)，在2型糖尿病人群中，75%的患者伴有肥胖[4]。有研究表明，當(dāng)肥胖患者通過調(diào)節(jié)飲食或運(yùn)動(dòng)有效的控制了體重，可以在一定程度上改善胰島素抵抗，減輕糖尿病癥狀[5]。除此之外，胰島素抵抗的機(jī)制還可能、糖毒性、脂毒性相關(guān)[6-7]，同時(shí)，胰島素的生物學(xué)效應(yīng)還受脂肪因子、PTP1B、PPARγ等多種因子的調(diào)節(jié)[8-9]。

脂肪細(xì)胞分為兩種，未分化的前脂肪細(xì)胞又叫小脂肪細(xì)胞，分化成熟的脂肪細(xì)胞又叫大脂肪細(xì)胞，其中大脂肪細(xì)胞數(shù)量增多和體積增大對(duì)脂肪的積累和肥胖的發(fā)生起著重要作用[10]。本實(shí)驗(yàn)采用3T3-L1前脂肪細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)并誘導(dǎo)其分化，在給予藥物干預(yù)后，觀察藥物對(duì)細(xì)胞的增殖及分化的影響。我們觀察到TTPGL對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，此時(shí)增加的是小脂肪細(xì)胞數(shù)量；在分化實(shí)驗(yàn)中，TTPGL顯著抑制細(xì)胞分化的作用，這在一定程度上可抑制大脂肪細(xì)胞的數(shù)量，避免肥胖的發(fā)生，與陽性藥Van作用相一致。

Figure 9.The effect of TTPGL on the relative protein levels of p-IRS-1 and p-Akt in IR adipocytes. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vsVan group.

圖9番石榴葉總?cè)茖?duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞p-IRS-1/IRS-1、p-Akt/Akt水平的影響

糖毒性與脂毒性在IR過程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)IR又會(huì)加重糖毒性與脂毒性，從而形成惡性循環(huán)[11-12]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用分化成熟的脂肪細(xì)胞建立胰島素抵抗模型，給藥處理后，觀察藥物對(duì)IR脂肪細(xì)胞糖脂代謝的影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無論是在基礎(chǔ)狀態(tài)下還是胰島素刺激狀態(tài)下，TTPGL在較低劑量下顯著促進(jìn)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗并抑制FFA的產(chǎn)生，具有改善 IR脂肪細(xì)胞糖脂代謝的作用。

脂肪組織是一個(gè)巨大的內(nèi)分泌器官，它可以分泌多種脂肪因子從而實(shí)現(xiàn)對(duì)糖脂代謝、炎癥等生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)。這些脂肪因子在體內(nèi)增多或減少，對(duì)胰島素生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮有重要影響[13]。研究表明一些脂肪因子例如脂聯(lián)素等具有胰島素增敏劑的作用[14]；另外一些脂肪因子如TNF-α、抵抗素等可引起胰島素抵抗[15-16]；瘦素對(duì)胰島素抵抗具有雙向調(diào)節(jié)作用，在一定濃度下具有抑制食欲促進(jìn)糖脂代謝的作用，當(dāng)出現(xiàn)瘦素抵抗，瘦素水平升高并引起胰島素抵抗[17]。在脂肪因子分泌的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)TTPGL顯著促進(jìn)了IR脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的分泌并抑制其TNF-α的分泌，在較高濃度下對(duì)抵抗素的分泌也有抑制作用，與陽性藥Van作用相似。

通過以上實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)TTGPL具有顯著改善3T3-L1胰島素抵抗脂肪細(xì)胞糖脂代謝以及脂肪因子分泌的作用，認(rèn)為其具有改善IR的作用，其作用與Van一致。Van作為PTP1B的抑制劑，通過抑制PTP1B而改善胰島素信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)

當(dāng)胰島素與胰島素受體結(jié)合后主要通過IRS-1/PI3K/Akt信號(hào)通路進(jìn)行級(jí)聯(lián)反應(yīng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]。在脂肪細(xì)胞中，胰島素首先與胰島素受體結(jié)合并使其激活，進(jìn)而使胰島素受體底物發(fā)生酪氨酸磷酸化，當(dāng)磷酸化的IRS與磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，可激活其催化亞基?；罨蟮腜I3K可使絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶磷酸化而使其激活，進(jìn)而刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[19]。在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙都可能引起胰島素抵抗。PTP1B作為胰島素信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，它可以通過使胰島素受體及胰島素受體底物發(fā)生酪氨酸去磷酸化[20]，阻礙胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起IR。

在接下來的實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)通過觀察TTPGL對(duì)PTP1B的mRNA表達(dá)以及p-IRS-1、p-Akt 蛋白量的影響，探討藥物作用機(jī)制。TTPGL在3 μg/L劑量下顯著抑制PTP1B的mRNA表達(dá)，0.3 μg/L劑量下對(duì)其無明顯作用；蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TTPGL在3 μg/L劑量下顯著增加p-IRS-1/IRS-1與p-Akt/Akt的水平，在0.3 μg/L劑量下對(duì)p-IRS-1/IRS-1無明顯作用，對(duì)p-Akt/Akt有一定的增加。我們可以推測(cè)TTPGL可能通過下調(diào)PTP1B的mRNA表達(dá)，并上調(diào)p-IRS-1與p-Akt蛋白，從而改善胰島素信號(hào)通路，與Van的作用相似。

從本實(shí)驗(yàn)中我們得出TTPGL具有改善3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的作用，其機(jī)制與Van相似，但Van存在強(qiáng)烈的胃腸道副反應(yīng)及腎毒性，而TTPGL是從植物番石榴葉中提取的中藥成分，抗糖尿病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)未見明顯的毒副作用，值得進(jìn)一步深入研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Total triterpenoids fromPsidiumGuajavaleaf improves insulin resistance in 3T3-L1 adipocytesLI Xiu-cun1, MA Jin-jin1, Zhao jing-jing2, YE Kai-he1, Lü Yan-qing1, WANG Xiao-kang1, WEI Song-cheng1, ZHANG Xiao-qi3, YE Chun-ling1

(1DepartmentofPharmacology,PharmacyCollege,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2PharmacyDepartment,GuangdongWomenandChildren’sHospital,Guangzhou511400,China;3InstituteofTraditionalChineseMedicineandNaturalMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:yechunling2005@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of total triterpenoids fromPsidiumguajavaleaf (TTPGL) on 3T3-L1 adipocyte insulin resistance (IR) and to explore the possible mechanism. METHODS: 3T3-L1 pre-adipocytes were cultured and induced to differentiate into 3T3-L1 adipocytes, then treated with TTPGL (0.3, 1, 3, 10 μg/L) for 48 h. The cells were divided into 0.1% DMSO group, positive drug sodium orthovanadate (Van, 10 μmol/L) group, model group and control group. The effect of TTPGL on the cell activity of pre-adipocytes was detected by MTT assay and its influence on the cellular differentiation was observed by oil red O staining. The IR model of the 3T3-L1 adipocytes was established successfully and then treated with different drugs for 48 h. The glucose consumption in the supernatant of IR adipocyte’s culture medium was assayed by glucose oxidase-peroxidase (GOD-POD), free fatty acid (FFA) levels were measured by colorimetric method, and adipocytokines levels were assayed by ELISA. The mRNA expression of protein tyrosine phosphatase-1B (PTP1B) of IR adipocyte was detected by real-time PCR. The protein levels of phosphorylated insulin receptor substrate 1/insulin receptor substrate 1 (p-IRS-1/IRS-1) and phosphorylated protein kinase B/protein kinase B (p-Akt/Akt) were determined by Western blot. RESULTS: Compared with DMSO group, TTPGL treatment significantly promoted the cell activity of 3T3-L1 pre-adipocytes and inhibited its differentiation (P<0.01). TTPGL (1～10 μg/L) improved glucose consumption of IR adipocytes significantly (P<0.01), with or without insulin stimulation, and TTPGL (0.3～3 μg/L) restrained FFA production remarkably(P<0.01). Compared with model group, TTPGL (0.3 and 3 μg/L) significantly increased the secretion of adiponectin in IR adipocytes (P<0.05), and inhibited the secretion of tumor necrosis factor-α (TNF-α) (P<0.01). TTPGL (3 μg/L) restrained the secretion of resistin significantly (P<0.05), and showed no significant effect on secretion of leptin. It also down-regulated the mRNA expression of protein tyrosine phosphates 1B (PTP1B) in IR adipocytes significantly (P<0.01), and increased the protein levels of p-IRS-1/IRS-1. TTPGL (0.3 and 3 μg/L) up-regulated the protein level of p-Akt/Akt in IR adipocytes significantly (P<0.05).CONCLUSION: TTPGL reduces IR in 3T3-L1 adipocytes. The mechanism may be that TTPGL significantly down-regulated mRNA expression of PTP1B and increased the protein levels of p-IRS-1/IRS-1 and p-Akt/Akt in IR adipocytes.

[KEY WORDS]Total triterpenoids fromPsidiumguajavaleaf; Insulin resistance; Protein tyrosine phosphatase 1B; Insulin receptor substrate 1; Protein kinase B

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.021

[中圖分類號(hào)]R285; R363; R965.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 020-85223843; E-mail: yechunling2005@163.com

*[基金項(xiàng)目]廣東省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目(No. cxzd1111)

[收稿日期]2015- 06- 29[修回日期] 2015- 12- 22

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)02- 0314- 07