活血消異方對子宮內膜異位癥模型小鼠體外受精-胚胎移植妊娠結局的影響

崔陽陽，孫偉偉，趙瑞華*，徐彩，吳天思，2

(1.中國中醫科學院廣安門醫院婦科，北京　100053；2. 北京中醫藥大學，北京　100029)

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活血消異方對子宮內膜異位癥模型小鼠體外受精-胚胎移植妊娠結局的影響

崔陽陽1，孫偉偉1，趙瑞華1*，徐彩1，吳天思1，2

(1.中國中醫科學院廣安門醫院婦科，北京100053；2. 北京中醫藥大學，北京100029)

【摘要】目的評估活血消異方對子宮內膜異位癥模型小鼠體外受精-胚胎移植(IVF-ET)妊娠結局的影響。方法根據胚胎供體小鼠(中藥組、模型組和假手術組)和接受胚胎移植的假孕小鼠(中藥組、模型組和假手術組)的來源，兩兩組合，將實驗分為9組進行IVF-ET，移植7 d后，觀察不同條件下的妊娠率及活胎率。結果IVF-ET后，9組小鼠的妊娠率比較有顯著性差異(P<0.05)。通過分組比較，中藥-假手術組、模型-假手術組及假手術-假手術組的IVF-ET妊娠率有顯著性差異(P<0.05)；假手術-中藥組、假手術-模型組及假手術-假手術組的IVF-ET妊娠率有顯著性差異(P<0.05)。9組活胎率由高到低依次為假手術-假手術組、假手術-中藥組、中藥-中藥組、中藥-假手術組、中藥-模型組、假手術-模型組、模型-假手術、模型-中藥組、模型-模型組，組間比較有顯著性差異(P<0.05)。結論活血消異方可提高模型小鼠IVF-ET的妊娠率及活胎率。

【關鍵詞】子宮內膜異位癥；不孕；體外受精-胚胎移植

(JReprodMed2016，25(2)：166-171)

子宮內膜異位癥(EM)簡稱內異癥，是指具有生長功能的子宮內膜組織出現在宮腔以外部位的一種雌激素依賴性疾病。內異癥是育齡婦女的常見病、多發病，以疼痛和不孕為主要特點。有數據顯示近年來內異癥的發病率呈現逐年上升的趨勢，且發病年齡趨于年輕化。內異癥與女性不孕密切相關，有研究報道高達40%～60%的內異癥患者合并不孕癥[1]，而不孕癥患者中約40%～50%的人存在內異癥。內異癥是引起女性不孕的主要原因之一，內異癥患者合并不孕癥的風險為非內異癥人群的20倍[2]。2000年Buyalos等[3]首次提出“內異癥相關不孕癥”(Endometriosis-associated infertility)的概念。

隨著輔助生殖技術(ART)的發展及臨床應用，ART逐漸成為內異癥相關不孕癥患者最理想的助孕方式和治療手段。有研究報道，內異癥相關不孕癥患者行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕治療時胚胎移植率可達85%，但妊娠率僅為20%左右[4]。因此，如何提高這類患者助孕治療的妊娠率成為生殖領域醫生關注的熱點問題。這種高移植率和低妊娠率的現象提示，胚胎著床可能是影響其妊娠結局的關鍵性問題。前期研究發現，活血化瘀治療不僅能改善內異癥的臨床癥狀，還對合并不孕的患者有明顯的助孕作用，活血消異方能縮小異位內膜體積、改善內異癥的組織病理形態；有效降低異位內膜組織中細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、血管內皮生長因子(VEGF)等蛋白的表達[5]。本研究以中醫理論為指導，通過建立內異癥小鼠模型，結合IVF-ET技術，觀察內異癥模型小鼠胚胎發育的情況及妊娠結局，探討活血消異方對內異癥相關不孕癥患者妊娠結局的影響。

材料和方法

一、實驗材料

1. 實驗動物：選擇健康、性成熟的SPF級昆明雌性小鼠300只，7周齡，體重(25±3)g；昆明雄性小鼠50只，10周齡，體重(33±2)g。所有實驗動物購自中國醫學科學院動物所[SCXK(京)2009-0007]。實驗動物飼養于中國中醫科學院廣安門醫院SPF級動物實驗室，光照明暗時間為12/12 h，室溫22℃。飼養動物所需的籠具及飲水瓶均由專業飼養人員高壓滅菌后提供。昆明小鼠雌鼠用于模型小鼠的供體與受體，昆明雄性小鼠用于精子供體及假孕鼠制作。

2. 主要試劑和藥物：HTF和KSOM 培養液 (ARK-Resource，日本)；人絨毛膜促性腺激素(HCG)和孕馬血清促性腺激素(PMSG)均購自寧波第二激素廠；羧甲基纖維素鈉(Solarbio，北京)；礦物油(Sigma，德國)；嘴吹管及移植針(Sigma，德國)。其他實驗材料、試劑及藥物(包括中藥)全部由廣安門醫院制劑室提供。其中HTF用于體外受精，KSOM用于培養受精卵直至囊胚期，培養液使用前于5%CO2、恒溫37℃、濕度飽和的培養箱中過夜預熱平衡。

中藥活血消異方由莪術、丹參、赤芍、雞內金、生薏仁組成，由廣安門醫院制劑室提供。上述生藥加10倍量水，煎煮3次，每次1 h，合并煎液、過濾，放置24 h，濃縮。藥物濃度為1.8 g生藥/ml，藥液4℃冰箱保存。

二、研究方法

1. 實驗分組：按照2細胞與假孕鼠(詳見后文描述)不同組別的來源，將實驗小鼠分為9組進行IVF-ET，具體分組情況見表1。

表1　實驗小鼠進行IVF-ET的分組

2. 內異癥小鼠模型的建立及處理：將實驗雌性昆明小鼠分為中藥組、模型組和假手術組進行內異癥小鼠模型的建立。選擇動情周期正常的小鼠，通過內膜碎片注射法[6-7]建立內異癥模型小鼠，假手術組給予等量生理鹽水注射。模型建立2周后，開始進行中藥干預。依據換算公式計算，小鼠等劑量的給藥量約為臨床成人每公斤體重用藥量的10倍。每只小鼠每次灌胃量為0.2 ml/10 g，連續 3個周期(5 d為1周期)。模型組、假手術組依據體重給予等量0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃。

3. 促排卵及卵母細胞的采集：各組分別取供卵鼠腹腔注射PMSG 10 U/只，48 h后腹腔注射HCG 10 U/只。注射HCG 14 h后進行取卵。脫頸處死供卵小鼠后打開小鼠腹腔，剝離組織，尋找子宮、輸卵管、卵巢和脂肪墊，這時可見子宮系膜，其連接生殖道和體腔壁，并帶有明顯的血管。用鑷子將輸卵管、卵巢和脂肪墊拉出，用小剪刀剪開輸卵管和卵巢，并將靠近輸卵管的子宮部剪下。將輸卵管攜帶子宮的部分置于培養滴中，移至體視顯微鏡(ZOOM2000，Leica，德國)下進行操作，用16號針輕輕劃破輸卵管膨大的壺腹部，可見云霧狀的卵母細胞及卵丘團釋放出來，將卵丘團引入HTF培養滴中。將取出的卵母細胞置于5%CO2、恒溫37℃、濕度飽和的培養箱中待用。

4. 精子的采集：脫頸處死雄性小鼠，開腹進入腹腔剪下睪丸及附睪，迅速分離出附睪尾和輸精管，并盡可能去除脂肪和血管。在體視顯微鏡下，使用26號針于附睪尾遠端小管處刺破，慢慢擠出精子，挑出精子置于HTF培養滴中，將培養皿放入培養箱中靜置1 h使精子獲能。受精時，調整精子濃度約為(1～2)×106個/ml。

5. IVF：精子獲能后，將精子加入卵母細胞培養皿中，置于培養箱中靜置6 h。6 h后使用HTF沖洗受精卵2～3次，沖洗后將受精卵置于新鮮的KSOM培養液中，在倒置顯微鏡下對受精卵進行計數后，重新置于培養箱中培養。受精24 h后，可見到較早卵裂的2細胞。部分2細胞培養至囊胚，觀察卵裂及胚胎發育情況；部分進行2細胞移植的2細胞供體。

6. 胚胎移植[8]：將性成熟的雌性小鼠與輸精管結扎術后的雄性小鼠合籠，次日上午9：00檢查雌鼠陰道涂片，見陰道栓者為假孕鼠，計為0.5 d。以此假孕鼠作為胚胎移植的受體鼠。挑選0.5 d假孕鼠，以0.9%水合氯醛進行腹腔注射麻醉，刮凈假孕鼠脊背下部并進行常規消毒。把小鼠移到體視顯微鏡下，距脊柱左側約1 cm處橫向切一小口，鈍性分離組織，暴露卵巢及脂肪墊，夾起脂肪墊，拉出左側卵巢、輸卵管及子宮，將輸卵管和卵巢留置體外。在移卵管吸入2細胞前，為了使移植時操作過程易于控制，首先吸入少量礦物油及氣柱，再拾入15枚2細胞，將2細胞從小鼠輸卵管傘端吹入后，將小鼠從顯微鏡臺上移下，將脂肪墊、子宮、輸卵管及卵巢放回體內，1～2針縫合體壁。重復以上步驟轉移胚胎至右側輸卵管。縫合皮膚，放回籠中待蘇醒。每只假孕鼠每側子宮移植15枚2細胞。在胚胎移植7 d后，脫頸處死小鼠，觀察胚胎移植后小鼠的妊娠率及活胎率。

活胎及活胎率的判斷標準[9]：活胎數：妊娠7 d，孕體鮮明，判為存活。活胎率計算公式：活胎率=存活的胚胎數/移植胚胎數。

三、統計方法

采用SPSS 17.0軟件包進行數據分析，計數資料采用χ2檢驗，當總頻數n≥40且所有理論頻數≥5時，用Pearsonχ2統計量；在總頻數n>40但理論頻數≥1時，用校正χ2統計量；在總頻數n<40或理論頻數<1時，用Fisher確切概率法檢驗，組間比較采用兩兩四格表的χ2檢驗。按α=0.05水準，P<0.05為差異有統計學意義。

結果

一、內異癥小鼠模型建立

內異癥模型小鼠可見皮下和腹腔均有病灶生成，且異位病灶生長良好。小鼠皮下病灶，肉眼觀多為白色、紅色或淡黃色米粒大小的結節或囊狀病灶，活動度小；腹腔內病灶，肉眼觀多為隆起囊狀，囊內充滿淡黃色清亮透明或混濁粘稠積液，表面血管清晰可見，病灶2～5 mm3大小不等。小鼠皮下及腹腔有不同程度的黏連。內異癥小鼠模型病灶組織HE染色結果見圖1：異位病灶中有血管生成，并有大量腺體和間質存在。此前預實驗觀察，建模共14只小鼠，1只未在腹腔及皮下找到病灶，僅見腹腔及皮下黏連，成功建模13只。同時在本實驗中觀察，90%以上的模型小鼠有上述異位病灶生成，提示“腹腔+皮下”注射法建立內異癥模型小鼠的成功率約達90%以上。

A：正常小鼠子宮內膜，箭頭所指為正常子宮內膜腺體及血管；B：內異癥模型小鼠子宮異位病灶，箭頭所指為異位病灶生成的腺體和血管圖1　正常小鼠子宮內膜與內異癥模型小鼠子宮異位癥灶 HE染色，×200

二、活血消異方對內異癥模型小鼠IVF-ET妊娠率的影響

通過3組不同來源的胚胎和3組不同來源的假孕鼠進行IVF-ET后，觀察其妊娠情況(表2)。通過Fisher精確概率法檢驗，9組小鼠IVF-ET后的妊娠率比較具有顯著性差異(P=0.000)。

表2　各組小鼠IVF-ET后妊娠情況(n，%)

注：中藥-模型組與模型-模型組中分別有1只小鼠因腹腔內嚴重黏連無法進行移植

根據胚胎和假孕鼠的來源，進行分組比較。假孕鼠來源于假手術組的3組進行比較，通過Fisher精確概率法檢驗發現，模型-假手術組的妊娠率顯著低于中藥-假手術組和假手術-假手術組(P<0.05)；中藥-假手術組和假手術-假手術組的妊娠率比較無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3　假孕鼠來自假手術組的各組IVF-ET

注：與中藥-假手術組和假手術-假手術組比較，*P<0.05

胚胎來源于假手術組的3組進行比較，通過Fisher精確概率法檢驗發現，假手術-模型組的妊娠率顯著低于假手術-中藥組和假手術-假手術組(P<0.05)；假手術-中藥組和假手術-假手術組的妊娠率比較無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4　胚胎來源于假手術組的各組IVF-ET

注：與假手術-中藥組和假手術-假手術組比較，*P<0.05

三、活血消異方對內異癥模型小鼠IVF-ET活胎率的影響

通過IVF-ET技術觀察并比較各實驗組的活胎率，因百分率資料不服從正態分布，采用Kruskal-Wallis H非參數檢驗，9組小鼠的活胎率比較有顯著性差異(Chi-Squareχ2=40.226，P=0.000)。根據平均秩次，9組小鼠的活胎率由高到低依次為假手術-假手術組、假手術-中藥組、中藥-中藥組、中藥-假手術組、中藥-模型組、假手術-模型組、模型-假手術、模型-中藥組、模型-模型組(表5)。

討論

古代中醫文獻中未對內異癥的病名進行記載，但根據內異癥的病因、病理機制及臨床表現可歸于“痛經”、“癥瘕”、“不孕”和“月經不調”等疾病的范疇。中醫認為血瘀為內異癥的病理機制，瘀血是內異癥的主要致病因素和病理產物。瘀血阻滯，不通則痛；血瘀日久，可成癥積。我院李光榮教授以“離經之血”立論，組成系列方藥，其中以核心藥物(丹參、赤芍、莪術等)組成活血消異方，臨床療效顯著[5，10]。方中丹參，或癥瘕積聚而脹悶痞塞[11]，有活血調經、祛瘀止痛之功效。赤芍出自《神農本草經》，有活血祛瘀、散瘀止痛之功。素杲云“赤芍藥破瘀血療腹痛”[12]。莪術，用于血瘀或氣滯血瘀之經閉腹痛、瘀阻、癥瘕積聚[13]，始載于《藥性論》，能入氣分血而行氣血之滯，有破血祛瘀、行氣消積止痛之功。活血消異方以丹參、赤芍、莪術相伍，共奏活血化瘀、散結止痛之效。

目前，國內外內異癥模型的實驗動物主要有兔、鼠及靈長類動物等，主要的建模方法包括傳統的自發性動物模型和誘發性動物模型(包括自體移植和異體移植)以及一些新型的特殊內異癥動物模型[14]。本研究中實驗動物選擇現階段國內內異癥相關研究最為常用的小鼠作為實驗對象，其動情周期短而規律，性成熟早，繁殖力強。由于實驗程序相對復雜且時間較長，本研究選擇子宮內膜“皮下+腹腔”注射法建立模型，保留小鼠完整的子宮，便于觀察病灶，并能減少手術操作的刺激和對盆腔微環境的影響，同時也能減少動物感染的幾率和對其生命力的損傷，保證實驗的可實施性，為后續實驗的順利進行提供保障。利用動物模型可以探討內異癥影響妊娠功能的可能機理、藥物對妊娠功能相關的分子生物學影響以及改善妊娠功能的治療等。

有文獻指出，小鼠行胚胎異體移植并不影響妊娠結局[15]，本研究亦是基于胚胎異體移植不會影響實驗結果來進行交叉分組設計。本研究通過建立內異癥小鼠模型，結合IVF-ET技術，觀察活血消異方對內異癥模型小鼠行IVF-ET后妊娠率和活胎率的影響，通過3組不同來源的胚胎和3組不同來源的假孕鼠進行IVF和ET，觀察9組小鼠胚胎移植后7 d的妊娠率及活胎率。結果顯示，內異癥可能影響小鼠的胚胎質量和子宮內膜環境，進而降低IVF-ET后的妊娠率及活胎率，活血消異方可以提高內異癥模型小鼠IVF-ET后的妊娠率及活胎率，提示其可能有助于改善胚胎質量及子宮內膜環境，提高子宮內膜容受性，促進胚胎著床和胚胎生長發育。

越來越多的證據表明，內異癥相關不孕癥與胚胎質量和子宮內膜容受性有密切關系。中醫治療在改善子宮內膜容受性和胚胎質量上取得了一定肯定的效果。有研究報道，補腎活血治療可以提高內異癥患者子宮內膜容受性，誘發成熟卵泡排卵，促進黃體發育，提高黃體功能[16-17]。王艷妮等[18]研究發現對內異癥患者IVF-ET周期的各階段采用補腎活血法治療，可獲得良好的妊娠率。隨著ART的應用普及，為一些內異癥相關不孕癥患者帶來福音，有研究者認為，輕度內異癥患者通過適當的期待妊娠后仍未妊娠者，就可以積極采取ART助孕治療[19]，但臨床實際中ART并不能解決所有問題，它可能繞過某些與內異癥相關的基礎疾病，但疾病本身可能影響助孕治療的結局。因此，如何安全、有效地提高內異癥患者助孕治療的妊娠率，是中西醫領域共同面臨的難題。

綜上所述，本研究結果提示活血消異方可以有效改善內異癥相關不孕癥患者的妊娠結局，為中醫藥治療提高內異癥患者的臨床妊娠率提供科學依據，并為進一步探討中醫藥在內異癥輔助生殖領域中的應用奠定基礎，但后續仍需進一步的深入研究其可能的作用機理及分子生物學調控機制。

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[編輯：陸彩玲]

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本刊編輯部

Effects of Huoxue Xiaoyi Fang on embryo development after IVF-ET in endometriosis model mice

CUIYang-yang1，SUNWei-wei1，ZHAORui-hua1*，XUCai1，WUTian-si1,2

1.DepartmentofGynecology，Guang’anmenHospital，ChinaAcademyofChieseMedicalSciences，Beijing100053

2.BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029

【Abstract】

Objective： To evaluate the effect of Huoxue Xiaoyi Fang on pregnancy outcome after IVF-ET in endometriosis (EM) model mice.

Methods： According to the sources [traditional Chinese medicine (TCM) group，EM model group，Sham-operation group] of mice of embryos donor and pseudopregnant mice accepted embryos transfer，the mice were divided into nine groups for IVF-ET after One-to-one cross combination. The pregnancy rate and the live embryo rate after 7 days of embryo transplantation (ET) were observed and compared among the nine groups.

Results： The pregnancy rate of nine groups were significantly different (P<0.05). The pregnancy rate after IVF-ET was significantly different among TCM-Sham operation group，EM model-Sham operation group and Sham operation-Sham operation group (P<0.05). The pregnancy rate after IVF-ET were significantly different among Sham operation-TCM group，Sham operation-EM model group and Sham operation-Sham operation group (P<0.05). The live embryo rate of nine groups were sequenced from high to low as follows：Sham operation-Sham operation group，Sham operation-TCM group，TCM-TCM group，TCM-Sham operation group，TCM-EM model group，Sham operation-EM model group，EM model-Sham operation group，EM model-TCM group and EM model-EM model group，and the differences were significant among the groups(P<0.05).

Conclusions： Huoxue Xiaoyi Fang can improve the pregnancy rate and the live embryo rate after IVF-ET.

Key words：Endometriosis；Infertility；IVF-ET

【作者簡介】崔陽陽，女，山西太原人，碩士，中醫婦科學專業.(*通訊作者，Email：rhzh801@126.com)

【基金項目】國家自然科學基金(No. 81173297)

【收稿日期】2015-05-25；【修回日期】2015-07-12

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.2.012