APMP廢水生物降解菌群的構建

李玉嬌 劉 玉 陳洪雷

(齊魯工業大學制漿造紙科學與技術教育部重點實驗室,山東濟南,250353)

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·APMP廢水處理·

APMP廢水生物降解菌群的構建

李玉嬌 劉 玉 陳洪雷

從APMP廢水及好氧污泥中篩選出11株微生物菌株,并檢測它們降解APMP廢水中有機污染物的能力。結果顯示,菌株W2、W4、W5、W7、S4、S5具有較強的有機污染物降解能力,其中,菌株S4的降解效果最佳,處理APMP廢水120 h后,CODCr由6960 mg/L降至3351 mg/L,去除率達到51.9%。以這6株菌為出發菌株,結合統計學方法,采用6因素2水平的部分因子設計(FFD)實驗,以最高CODCr去除率為響應值,考察單因素作用及多因素相互作用對廢水降解的影響。結果表明,菌株W2、W4、W7、S4和S5是影響APMP廢水有機污染物降解的主要因素,可用于構建針對APMP廢水的優勢降解菌群。

APMP廢水；菌株篩選；COD；部分因子設計

(*E-mail: 13181724137@163.com)

堿性過氧化氫機械漿(APMP)廢水主要來源于木片汽蒸、洗滌、化學預處理及漿料的洗滌、篩選、濃縮等處理過程。APMP廢水中的COD和SS含量均較高,且顏色較深,毒性較大,對環境危害很大。制漿造紙廢水的處理方法主要有物理法、化學法、物理化學法和生物法。由于生物法具有效率高、成本低、二次污染少等優點得到廣泛的應用,廢水的生物處理技術就是利用微生物的新陳代謝功能,使廢水中呈溶解和膠體狀態的有機污染物降解并轉化為無害穩定的物質,從而使廢水得以凈化[1- 4]。目前對生物處理過程中高效菌種的研究也越來越多[5- 6],趙建[7]篩選出可用于造紙廢水處理的抗性菌株,出水COD和色度都穩定在一個比較好的水平,科研人員[8-10]利用構建的優勢降解菌群強化好氧顆粒污泥,提高制漿廢水的降解效果,在厭氧處理的基礎上,對原始好氧污泥處理后,廢水CODCr由629 mg/L降至203 mg/L,廢水色度由118 C.U.降至91 C.U.；而強化好氧污泥處理后,廢水CODCr由629 mg/L降至146 mg/L,廢水色度由118 C.U.降至72 C.U.。生物法處理制漿廢水的關鍵是提高微生物對有機物的降解效率,篩選得到高效降解菌從而優化降解菌群。本研究將從污泥和APMP廢水中提取出細菌,并篩選出高效菌株對其進行組合,找出降解效果最優的高效菌株的組合方式,達到高效處理APMP廢水的目的。

1 實 驗

1.1 原料

實驗菌種：從好氧活性污泥和 APMP 廢水中篩選菌株。

實驗廢水：楊木APMP綜合廢水,pH值為9.0,CODCr含量為6960 mg/L,BOD5含量為2920 mg/L。BOD5∶CODCr=0.42,大于0.3,可生化性較強。

1.2 培養基

無機鹽溶液：KH2PO4420 mg/L,K2HPO4375 mg/L,(NH4)2SO4244 mg/L,NaCl 30 mg/L,CaCl230 mg/L,MgSO4·H2O 30 mg/L,FeCl3·6H2O 3 mg/L。

磷酸緩沖液(PBS)：NaCl 8 g/L,KCl 0.2 g/L,KH2PO40.2 g/L,K2HPO41.15 g/L。

LB液體培養基：胰蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,NaCl 10 g/L。

LB固體培養基：在LB液體培養基中加入2%的瓊脂粉。

以上試劑均在121℃條件下滅菌15 min。

圖1 從不同介質中篩選出的菌落

1.3 菌株的篩選

無菌操作條件下,用移液槍分別從好氧污泥和APMP廢水中取50 μL,轉入10 mL、50 mL、100 mL無菌水中進行梯度稀釋,將稀釋后的廢水涂布于3個分離平板上(LB固體培養基),30℃條件下靜置培養36 h。

根據菌落生長的稀密程度,確定最佳稀釋濃度的分離平板,再以菌落的形貌為特征,從分離平板上選取不同菌落,采用劃線稀釋法將單一菌落接種于新分離平板上,以進一步篩選純菌株,放入細菌培養箱,30℃條件下靜置培養36 h。將生長出來的菌落再次接種于斜面固體培養基中,靜置培養36 h后,4℃保藏備用。

1.4 菌株的擴大培養及菌體收集

將分離的菌株分別接種于LB液體培養基中,30℃條件下振蕩培養(150 r/min),待到對數生長期時,將包含菌體的培養液倒入150 mL經滅菌處理的離心管(121℃條件下滅菌20 min)中,5000 r/min條件下離心10 min,棄上清液,PBS緩沖液洗滌2次,收集菌體備用。

1.5 菌體形態的微觀觀察

無菌操作下取出目標菌體,-80℃條件下冷凍干燥8 h,噴金后利用掃描電子顯微鏡(SEM,JSM 5600 LV)觀察各菌體的微觀形態。

1.6 菌株生長曲線的測定

微生物懸浮液中的菌體對透過菌株懸浮液的光線具有吸收作用,在一定范圍內,菌懸液中微生物的細胞濃度與透過的光密度成正比,因此可以利用該原理測量樣品溶液中的光密度,以此來代表菌株的生長曲線。

將篩選出的菌株在30℃、140 r/min的條件下進行培養,在600 nm下采用紫外可見分光光度計測定菌液的光密度值(OD600)。初始加入菌株的OD600為0.2,每隔4 h檢測其光密度值,當OD600不再增長時,停止檢測。

1.7 APMP廢水有機污染物的生物降解

分別取150 mL APMP廢水至300 mL錐形瓶中,調節pH值為7.0，在121℃條件下滅菌20 min。將擴大培養后的菌株投加至廢水中,使其在廢水中的光密度值(OD600)為0.2,30℃下振蕩培養(150 r/min),每隔6 h取水樣5 mL檢測其COD值,至COD值不再下降時結束實驗。

1.8 廢水的COD檢測

采用重鉻酸鉀法進行測定。

1.9 優勢菌群篩選實驗設計

運用部分因子設計(FFD)優化,通過Minitab軟件對部分因子及全因子設計數據進行回歸分析。

2 結果與討論

2.1 從廢水和污泥中篩選降解菌

將APMP廢水和活性污泥適當稀釋后涂布于LB固體培養基中,放入30℃培養箱,靜置培養36 h,觀察菌株生長情況，如圖1所示。由圖1可知，平板上生長出不同的微生物菌落,它們在菌落色澤、質地、形狀、表面粗糙度等形貌特征方面存在明顯差異。將不同菌落采用劃線稀釋法重新接種于分離平板上,進一步純化菌株。

對取自APMP廢水和好氧活性污泥中的菌株進行篩選、分離,總共得到了11株的微生物菌體，其中6種來自APMP制漿廢水(W1、W2、W3、W4、W5、W7),5種來自好氧活性污泥(S1、S3、S4、S5、S6)。

圖2 各菌株的SEM圖片

2.2 菌株個體微觀形態的觀察

掃描電鏡能夠觀察到菌株的個體外觀形態、長度、寬度等基本特征,從而能夠更好地分析篩選出來的菌株。各菌株的基本特征見表1。

圖2是從APMP廢水和好氧活性污泥中篩選出來的菌株的SEM圖片。由表1和圖2可知,11種菌株的長度范圍為1.5～7 μm,除W5、S3的寬度為0.5、2 μm以外,大部分菌株的寬度為1 μm左右,W1、S1的外觀形態相同,都是長棒狀,前后粗細均勻,其余的9種菌株在外觀形態方面各不相同,因此可以斷定篩選出的11種菌株屬于不同的菌種。

表1 各菌株基本特征

2.3 菌株對APMP廢水COD的去除效果

不同菌株對APMP廢水COD的去除效果如表2所示。由表2可知，在篩選出的11株菌中,降解能力由大到小依次是：S4>W7>W2>S1>S6>S5>S3>W4>W3>W1>W5。其中,S4的降解效果最佳,處理120 h后,APMP廢水CODCr由6960 mg/L降至3351 mg/L,去除率達到51.9%；菌株W7處理APMP廢水120 h后,CODCr由6960 mg/L降至3445 mg/L,去除率達到50.5%,菌株W2的CODCr去除率也高達50%。

表2 不同菌株對APMP廢水COD的去除效果

根據各菌株在不同時間段的吸光度可知,W3、S1、S3、S6基本沒有生長,OD600在0.2左右徘徊,因此不適宜用作處理APMP廢水的高效菌株,并且W5的生長狀況良好,較W1有生長優勢,再根據表2各菌株對廢水的處理效果,篩選出W2、W4、W5、W7、S4、S5這6種高效降解菌。

圖3為這6種菌株對APMP廢水COD的去除情況。從圖3可以看出，大多數菌落在第120 h左右時的去除效果最好,因為此時大多數菌落處于穩定期,增長速度很快,所以降解效果最好。總的來說,隨著時間的增長CODCr是不斷降低的,然后保持穩定或略有增長。因為在穩定期細菌的生長和死亡呈動態平衡,所以CODCr基本不變,略有增長的原因是因為細菌死亡的速度大于生長速度。

圖3 各菌株對APMP廢水COD的去除曲線圖

2.4 菌株生長曲線

菌株在一種溶液中的生長發育狀況可以通過菌株的生長曲線來了解,菌株的4個生長周期分別為隱晦期、對數生長期、穩定期和衰亡期,通過菌株生長曲線的測量,可以推測菌株在不同時間的生長狀況。一般處理廢水大都采用處于穩定期的菌株,這個時期菌株的數量和周圍環境達到了一個動態平衡,能夠平穩地降低廢水中的污染物質,從而達到降低廢水COD的目的。

圖4 各菌株的生長曲線圖

由圖4各菌株的生長曲線圖可知，W4、W5、W7、S4有著相似的生長規律,接種后的0～36 h為隱晦期,36～56 h為對數生長期,菌落開始快速增長,56～96 h為穩定期,細菌的生長和死亡呈動態平衡；S5、W2細菌的增長速度很快,接種后即開始增長,0～28 h為對數生長期,其后一直保持著穩定的增長速度,60～96 h為穩定期,細菌的生長和死亡呈動態平衡。

2.5 統計學方法構建APMP制漿廢水優勢降解菌群

以W2、W4、W5、W6、S3、S4 這 6 株菌作為分析因子,最高CODCr去除率(Rmax)為響應做6因素2水平的部分因子設計(FFD)實驗,用于評估單株菌及混合菌對廢水COD去除的影響,變量值如表3所示。

表3 部分因子設計實驗編碼值與實際值

6因素全因子分析需要64(26)組實驗來評估主效應和交互效應,在本研究中,為減少工作量,選用部分因子分析設計,由16種實驗構成的設計方案,在設計方案中,實驗順序隨機排列,實驗順序詳細信息及響應值Rmax見表4。

表4 實驗設計和部分因子實驗結果

圖5為不同菌株或菌株聯合對廢水COD去除率的正態概率圖。在圖4中對響應即COD去除率有顯著影響的因子離正態概率線較遠,這些影響因子對COD降解有重要貢獻；對響應沒有顯著影響的因子離正態概率線較近,這些較近的點的影響可以忽略不計。

因此從圖5可以看出,單變量W4、S4和S5對廢水COD的去除有重要意義。此外,在這個模型中有3種顯著的交互作用,分別是X1X4、X1X2和X1X2X6。在這3種顯著的交互作用中,X1X4和X1X2X6對Rmax產生積極的影響,而X1X2則有消極的影響。通過運用多元回歸分析對實驗數據進行分析并且忽略那些95%置信區間內不顯著條件,從FFD中可以獲得一個一價模型方程：

圖5 不同菌株或菌株聯合對廢水CODCr去除率的正態概率圖

Rmax=32.64+7.77X2+9.15X5+6.47X6+3.29X1X4- 4.11X1X2+3.31X1X2X6

從方程中可以看出,X1(W2)、X2(W4)、X4(W7)、X5(S4)和X6(S5)對APMP制漿廢水COD的降解都有不同程度的影響,而X3(W5)對廢水COD的降解沒有顯著影響。因此,可選出W2、W4、W7、S4和S5這5株菌構建APMP制漿廢水的優勢降解菌群。

3 結 論

3.1 利用稀釋倍數法和劃線稀釋法,從APMP制漿廢水和好氧污泥中共篩選純化出11株菌株,根據各菌株在掃描電鏡下的圖片分析其基本特征,并結合COD去除效果和生長曲線圖篩選出W2、W4、W5、W7、S4、S5這6種高效降解菌。其中S4的降解效果最佳,處理APMP廢水120 h后,CODCr由6960 mg/L降至3351 mg/L,去除率達到51.9%；菌株W7處理APMP廢水120 h后,CODCr由6960 mg/L降至3445 mg/L,去除率達到50.5%；菌株W2的去除率也高達50.0%。

3.2 以6株菌株為出發菌株用于降解APMP制漿廢水中的有機污染物,先通過部分因子設計(FFD)實驗,再運用多元回歸分析,菌株W2、W4、W7、S4和S5是影響APMP廢水降解有機污染物的主要因素,可用于構建針對APMP廢水的優勢降解菌群。

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The Construction of Micro Flora for Degrading APMP Effluent

LI Yu-jiao*LIU Yu CHEN Hong-lei

(KeyLabofPulpandPaperScience&TechnologyofMinistryofEducation,QiluUniversityofTechnology,Ji′nan,ShandongProvince, 250353)

APMP(Alkaline Peroxide Mechanical Pulp ) effluent belongs to high concentrated organic wastewater with high COD content and pollution load, its treatment is necessary for surrounding environment. By using the method of dilution multiple and crossed dilution the bacteria were screened from the aerobic sludge and APMP waste water. The wastewater COD removal efficiency of each bacterium was tested, with absorbance spectrophotometry curves and scanning electron microscope (SEM) images. Through part of the factorial design (FFD) experiment, using 6 factors at two levels experimental design, COD removal rate as response values, the results showed that the five strains of bacteria W2, W4, W7, S4 and S5 could be used to construct the microflora for APMP effluent degradation bacteria.

APMP effluent; strain screening; COD; fractional design

李玉嬌女士,在讀碩士研究生；研究方向：植物資源化學工程與木質纖維基功能材料。

(齊魯工業大學制漿造紙科學與技術教育部重點實驗室,山東濟南,250353)

X793

A

10.11980/j.issn.0254- 508X.2016.01.007

2015- 08-16(修改稿)