3種不同染色方法對抗酸染色的影響

李國平， 王鵬程， 張 聲

3種不同染色方法對抗酸染色的影響

李國平， 王鵬程， 張 聲

目的 評價3種不同染色方法對檢出抗酸桿菌的影響。 方法 收集2012-2015年存檔的結核和麻風病例60例，分別采用不同的染色方法進行抗酸染色：第1種方法為傳統的Ziehl-Neelsen染色法；第2種方法是將脫蠟液由二甲苯改為松節油和汽油的混合液，且染色后不脫水，不透明，直接烘干、蓋片；第3種方法是在第2種方法的基礎上使用了添加表面活性劑Triton-100的染液。比較3種不同染色方法的染色效果及抗酸桿菌的檢出率。 結果 3種方法的檢出率分別為第1種方法20%、第2種方法31.7%、第3種方法41.7%，其中第3種方法與另外2種方法比較差別均具有統計學意義(P1vs3<0.001，P2vs3=0.031)。 結論 添加表面活性劑Triton-100的染液，染色效果及抗酸桿菌的檢出率明顯升高，具有較高臨床應用價值。

染色與標記； 表面活性劑； L型菌

對于抗酸桿菌，因為菌體壁上含有一定量的脂質，故抗酸染色一般不易著色，但是這類細菌一經染上顏色，又不易褪色，即使用酸類物質處理也不易脫色，故該類細菌又稱為抗酸桿菌[1]。常見的抗酸桿菌為結核桿菌、麻風桿菌及非典型分枝桿菌。在常規病理診斷中多采用傳統的Ziehl-Neelsen染色法，但是檢出率偏低。筆者科室經實踐摸索出提高抗酸桿菌的檢出率的方法，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 收集2012-2015年經臨床及病理確診的結核或麻風患者60例，男性42例，女性18例，年齡(52.43±9.81)歲(26～71歲)。60例組織均用4%中性甲醛固定(pH 7.2)，常規脫水、透明、石蠟包埋。

1.1.2 試劑 堿性復紅飽和液：10 g的堿性復紅溶于無水乙醇100 mL，過濾后備用；5%石碳酸水溶液：50 mL石碳酸+950 mL蒸餾水；汽油松節油液：航空汽油50 mL+松節油50 mL；10% Triton-100溶液；蘇木精溶液：蒸餾水750 mL，硫酸鋁鉀17.5 g，蘇木精2.0 g，碘酸鈉0.2 g，冰乙酸8 mL；二甲苯；各梯度濃度的酒精；中性封片劑；1%鹽酸酒精：1 mL HCl+99 mL 70%乙醇；石碳酸復紅溶液：堿性復紅5 mL+5%石碳酸水溶液45 mL；5% Triton-100石碳酸復紅溶液：5%石碳酸水溶液42.5 mL，堿性復紅5 mL，10%Triton-100溶液2.5 mL。

1.2 方法 (1)第1種方法為傳統的Ziehl-Neelsen染色法。切片二甲苯脫蠟至蒸餾水。將切片置于石碳酸堿性復紅溶液30 min，用吸水紙將切片正反面染液吸干，用1%鹽酸酒精適度分化。流水沖洗5 min，蘇木精淺染(1 min)，流水返藍。常規脫水，透明，中性樹膠封固。(2)第2種方法是將脫蠟液由二甲苯改為松節油和汽油的混合液。切片用汽油松節油脫蠟2次[2]，每次10～15 min。不用酒精洗，切片用吸水紙吸干。流水沖洗10 min，過蒸餾水1 min，浸入碳酸堿性復紅溶液30 min，用吸水紙將切片正反面染液吸干，用1%鹽酸酒精適度分化。流水沖洗5 min，蘇木精染1 min，流水返藍，烘干(不宜用乙醇脫水)，中性樹脂封固。(3)第3種方法是在第2種方法的基礎上使用了添加表面活性劑Triton-100的染液。切片用汽油和松節油的混合液脫蠟2次，每次10～12 min。不用酒精洗，切片用吸水紙吸干，流水沖洗10 min，過蒸餾水1 min。浸入10% Triton-100石碳酸復紅溶液30 min，用吸水紙將切片正反面染液吸干，用1%鹽酸酒精適度分化至切片染成粉色，水洗，流水沖洗5 min，蘇木精染1 min，流水返藍，烘干，中性樹脂封固。

1.3 結果判讀 結果均由雙人進行鏡檢，抗酸桿菌陽性菌體染色后呈鮮紅色，背景著色為淡藍色。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件分析數據，兩兩比較采用McNemar檢驗。P<0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

陽性結果：結核桿菌鏡下形態表現為細長微彎曲的桿狀菌，長短不一，兩端鈍圓；麻風桿菌常在泡沫細胞(麻風細胞)內聚集成堆，鏡下表現較粗短。抗酸桿菌陽性菌體染色后呈鮮紅色，胞核呈藍色，背景著色為淡藍色，對比清晰，無其他著色。陰性結果：未找到紅色桿菌，整張片子只有淡藍色背景。3種方法抗酸染色的陽性檢出率兩兩比較，差別均具有統計學意義(P1vs2=0.016，P1vs3<0.001，P2vs3=0.031，表1)，其中第3種方法的檢出率明顯高于其他2種方法。3種方法的染色效果見圖1。經第3種方法染色后，菌體更清晰，呈亮紅色，無折光，使得細菌的顏色與背景對比明顯，更易檢出，對于缺乏經驗者可能更容易檢出抗酸桿菌。

表1 3種抗酸染色方法在60例病例中的陽性檢出率

Tab 1 The positive rates of acid-fast staining in 60 cases by three methods respectively

與第1種方法比較，☆：P<0.05；與第2種方法比較，△：P<0.05.

3 討 論

抗酸染色作為診斷結核和麻風的一種重要特殊染色，是由抗酸桿菌的分子結構及其性質決定的。抗酸桿菌的表面因有一層類脂或脂質夾膜而不易著色，一旦著色，酸性酒精的作用不易將其脫色，故顯紅色的為抗酸桿菌，其他細菌及細胞呈藍色。筆者于臨床工作中對抗酸染色進行細節上的改良，從而提高抗酸桿菌的檢出率，可更好地服務于臨床。

抗酸染色在診斷結核病時也存在局限性。包括：抗酸桿菌的形態、大小不一，識別時存在差異；抗酸桿菌的識別需要油鏡觀察，對于手術切除的大組織塊難以觀察到全部組織，且抗酸桿菌在組織中分布不均勻[3]，客觀上存在一定的漏診率。如臨床高度疑為結核病，而抗酸染色鏡下形態學不典型，則需要選擇多塊蠟塊行抗酸染色[4]，以提高診斷率。因此，在臨床病理實踐中，摸索出可以改善抗酸染色效果及提高抗酸桿菌檢出率的方法就顯得尤為重要[5-6]。主要表現在以下幾個方面：(1)脫蠟液的選擇。人抗酸桿菌菌體含有脂質，易溶于酒精，為保護菌體的脂質不受破壞并保持菌體的完整性，故采用汽油和松節油的等量溶液做為脫蠟液進行脫蠟[7]，有效地避免了菌體的破壞，從而提高檢出率，但要經常更換，否則會出現組織脫蠟不凈或染料沉淀，造成整片紅色污染，即使用硫酸也無法脫色，染色結果不易判斷。(2)切片厚度的選擇。為提高切片內抗酸桿菌的含量，應適當增加切片厚度，一般為5～6 μm，并建議使用防脫蠟玻片，在65 ℃烤箱內延長烤片至2 h，防止掉片。(3)酒精對染色的影響。為避免染色后脫水用的不同濃度的酒精對脂質的破壞，切片染色烘干后直接蓋片進行觀察，染色后的切片不進行脫水透明。(4)表面活性劑的應用。由于抗酸桿菌的菌體含有一層蠟質，使得染液難以進入，致使染色效果不佳。有文獻報道，加入表面活性劑可明顯增加切片中分枝桿菌的被染色率[8-10]。Triton-100是具有與極性分子和非極性分子相結合的親水基團和親油基團的表面活性劑，通過降低物質表面張力使細胞通透性增加，提高染液的滲透力，使染色均勻，起助染劑的作用，明顯改善染色效果，提高檢出率。(5)分化液的把握。鹽酸酒精分化要適度，分化不足則染色背景較深，抗酸桿菌顯示不明顯；分化過度，使得一些抗酸桿菌因量較少或染色較弱，顯示不出來。較好的分化應在切片經水洗后顯示為淡淡的紅色為宜。(6)染色時間的控制。為了便于觀察，應嚴格控制復染的時間，肉眼觀察呈淺藍色即可，不宜過長。過度復染可能掩蓋陽性著色，造成假陰性，降低陽性率，要做到“寧淡勿深”。(7)觀察結果時的注意事項。由于在組織處理過程中，二甲苯及酒精對菌體的破壞，且大部分標本為非穿刺標本，抗酸桿菌含量較少，陽性率低，所以除染色因素會對觀察結果造成影響外，閱片人員的判斷能力也至關重要。正確辨認抗酸染色陽性桿菌是做出正確診斷的基礎，應在壞死的周圍組織尋找抗酸桿菌，并用油鏡進行觀察，提高檢出率。對于臨床上高度懷疑抗酸桿菌感染的標本應進行全視野觀察，克服視覺疲勞，多次反復閱片，防止因漏看而造成假陰性。建議進行雙人觀察染色結果，避免因個人的主觀性造成漏診或誤診，提高檢出率。

[1] 張 哲,陳 輝．實用病理組織染色技術[M]． 沈陽：遼寧科學技術出版社，1998:190-192．

[2] 中華醫學會．臨床技術操作規范病理學分冊[M]． 北京：人民軍醫出版社，2004:139-140.

[3] 王秀娥，王鄭瑩，王秀敏. 97例結核病變組織中抗酸染色結果的分析報道[J]．中國防癆雜志, 2007,10(29):130-131.

[4] Laga A C, Milner D A Jr, Granter S R. Utility of?acid-fast?staining for detection of mycobacteria in cutaneous granulomatous tissue reactions[J].AmJClinPathol，2014,141(4):584-586.

[5] Das S, Narang P, Nagamiah S,etal. Evaluation of variants of carbol fuchsinsolution to stain acid-fast bacilli in-situ by the pot method[J].IntJTubercLungDis, 2015,19(12):1470-1475.

[6] Shinu P, Nair A, Jad B,etal. Evaluation of two pretreatment methods for the detection of Mycobacterium tuberculosis in suspected pulmonary tuberculosis[J].BasicMicrobiol, 2013,53(3):260-267.

[7] 朱偉峰，彭風英．介紹一種改良抗酸染色法[J]. 福建醫藥雜志, 2007,29(2):175.

[8] 邱莎莎,鄧 曉,張瑞其,等. 介紹一種用卡介苗進行改良抗酸染色的實驗教學方法[J].微生物學雜志, 2008,28(6):109-110．

[9] 盧立軍,眭 翔,王一平,等．表面活性劑對結核桿菌染色效果的影響[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2001,17(6):538．

[10] Selvakumar N, Sekar M G, Iampuranan K L,etal. Increased detection byrestaining ofacid-fastbacilli in sputum samples transported in cetylpyridiniumchloride solution[J].IntJTuberLungDis, 2005,9(2):195-199.

(編輯：何佳鳳)

The Effects of Three Different Staining Methods on Acid-fast Staining

LI Guoping, WANG Pengcheng, ZHANG Sheng

Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China

Objective To evaluate the effects of three different stainingmethods on the detection of acid-fast bacilli. Methods We reviewed 60 cases of tuberculosis and leprosy archived from 2012 to 2015 in the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Three different staining methods were used for acid-fast staining. Method One: the traditional Ziehl-Neelsen staining method. Method Two: Instead of the original dewaxing liquid xylene,mixture of turpentine oil and gasoline was used andthe specimen underwent directly drying and glass covering after dying without dehydration and transparency. Method Three: In addition to what were in the Method Two, surfactant Triton-100 was used. The dyeing effects of the three different staining methods and the detection rates of acid-fast bacilli were compared accordingly. Results The detection rates with Method One, Method Two, and Method Three were 20%, 31.7% and 41.7% respectively. The differences shown in the pairwise comparisons with the three methods were statisticallysignificant (P1vs3<0.001,P2vs3=0.031). Conclusion The group with the addition of surfactant triton-100 dye produced a higher dyeing effect and detection rate of acid-fast bacilli than those of the other two groups. The third staining method tested provides higher value on clinical application.

staining and labeling; surface-active agents; L forms

2016-08-15

福建省衛生廳青年科研課題(2014-1-62)

福建醫科大學 附屬第一醫院病理科，福州 350005

李國平(1979-)，男，主管技師

張 聲. Email: zhgshg@126.com

R378； R446； R446.8

A

1672-4194(2016)06-0420-03