HBV共價閉合環狀DNA功能化納米顆粒制備及鑒定

郭永燦， 王友強， 魏 聰， 鄧 沖， 趙 容， 鄒 霞， 涂植光

HBV共價閉合環狀DNA功能化納米顆粒制備及鑒定

郭永燦1， 王友強1， 魏 聰1， 鄧 沖1， 趙 容1， 鄒 霞1， 涂植光2

目的 制備HBV共價閉合環狀DNA(cccDNA)功能化磁性納米顆粒，為進一步建立富集分離和檢測cccDNA方法奠定基礎。 方法 通過親和素修飾納米顆粒表面，利用親和素與生物素的親和作用，將親和素修飾的納米顆粒與生物素標記的cccDNA特異性探針偶聯，制備cccDNA功能化納米顆粒，最后用cccDNA探針完全互補的熒光標記序列與功能化納米顆粒反應，鑒定其特性。 結果 親和素修飾的納米顆粒能結合生物素最大量為1 205 ng/mg；通過與親和素作用，生物素標記cccDNA特異性探針固定在磁性納米微粒表面，其最大結合生物素標記探針量為3.2×10-9mol/mg；cccDNA功能化納米顆粒可捕獲與其互補的熒光標記寡核苷酸序列，其最大捕獲量為2.0×10-9mol/mg，并能通過變性釋放出保持生物學活性游離的熒光標記寡核苷酸序列。 結論 成功構建的cccDNA功能化納米微粒能有效捕獲與其互補的序列，其捕獲量能達到cccDNA的分離提取要求。

*DNA，病毒； DNA，環狀； 納米粒子

近年來，納米技術迅速發展，被廣泛應用到生物醫學各個研究領域。以納米或微米級磁性粒子為載體的磁性分離技術主要利用固定在粒子表面的蛋白質或單鏈核苷酸探針的親和作用與靶分子或互補序列結合，目標靶分子因與磁性粒子特異性結合后在磁場作用下，通過抗原-抗體或核酸分子雜交、分離、清洗等簡便、快速操作，從復雜的生物體系中被分離[1]。本研究擬通過已制備的磁性納米微粒，經親和素修飾，再與生物素標記HBV共價閉合環狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)特異性探針偶聯，制備cccDNA功能化納米顆粒，為富集分離和檢測cccDNA奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 鏈霉親和素、生物素標記辣根過氧化物酶、四甲基聯苯胺(美國Sigma公司)；PBST緩沖液(1×PBS，0.05% Tween-20)，STE(NaCl-Tris-EDTA)結合/清洗緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA， pH 7.4)，雜交緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl，pH 8.0)，PBS緩沖液(20 mmol/L Na2PO4/NaH2PO4，pH 7.5)等自配；其他化學試劑均為分析純，購于北京索萊寶公司。

1.1.2 儀器 紫外可見分光光度計(ND1000，美國NanoDrop公司)；熒光分光光度計(2300EnSpire，芬蘭PerkinElmer公司)；酶標儀(SunriseTM，奧地利Tecan公司)。

1.2.1 親和素修飾納米微粒的制備 將已制備的納米顆粒用PBS配制為5 mg/mL的納米懸濁液。取超聲分散懸濁液500 μL，加入1 mg/L親和素液50 μL，室溫振蕩24 h。反應畢，加入1 mL的戊二醛封閉反應2 h，PBS洗滌3次，磁性分離去上清，最后用1 mL PBS分散親和素修飾磁性納米微粒。取5支離心管，分別取100 μL已修飾磁性納米懸濁液(含親和素約5 μg)，每管加入10，20，40，60及80 ng生物素，反應20 min后各管加入經稀釋生物素標記辣根過氧化物酶50 μL，避光反應20 min，加入TMB底物顯色5 min后用2 mol/L H2SO4終止反應，然后用酶標儀檢測各管溶液在450 nm處OD值。以生物素加入量為橫坐標，相應吸光度為縱坐標，以95%生物素標記辣根過氧化物酶活性被抑制來計算親和素修飾磁性納米顆粒能結合生物素容量。

1.2.2 cccDNA特異性探針設計與合成 在GenBank數據庫中查找人源HBV完整序列，剔除人工構建質粒序列，將余下的序列導入序列比對軟件進行比對，找出順向重復序列(direct repeat，DR)1和2區間的同源序列；將同源序列導入Oligo7(version 7.37)軟件，設計cccDNA特異性的互補探針序列。將設計探針序列在Pubmed上進行BLAST比對后，對照相關文獻[2-3]，驗證后選定4條探針，分別是：

probe 1：5′ACTCTCAGCAATGTCAACGACCGACC3′(26 nt);

probe 2：5′CTTCGCTTCACCTCTGCACGT3′(21 nt);

probe 3：5′TGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAAT

TGGTCTGTT3′(35 nt);

probe 4：5′AGGTTAATGATCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGTT3′(49 nt)

1.1 對象 選擇2008年6月—2009年10月在上海市靜安區靜安寺社區衛生中心、曹家渡社區衛生中心、南京西路社區衛生中心的老年住院患者共202例，隨機分為干預組和對照組各101例。

所有序列5′用生物素標記，交由生工生物工程(上海)股份公司合成和標記。

1.2.3 cccDNA功能化微粒制備 取親和素修飾磁性微粒混懸液250 μL(含微粒約250 μg)，平均分為5管，每管加入一定量(5，10，15，20和25 μL)10 μmol/L生物素化標記寡核苷酸探針，在37 ℃恒溫搖床中以150 r/min反應2 h。完畢后，磁性分離，以清洗緩沖液洗滌3次。測定偶聯前后以及清洗后上清液在260 nm處的OD值，確定納米顆粒與生物素化探針反應的最佳比例、偶聯效率及固定化量。各組探針的偶聯效率及固定化量符合反應要求，用封閉液進行封閉，制備cccDNA功能化微粒。

1.2.4 cccDNA功能化微粒鑒定 設計與生物素標記探針序列完全互補的寡核苷酸序列，同時設計與4條cccDNA序列完全不互補序列為對照序列(表1)，交由生工生物工程(上海)股份公司合成和標記。取50 μL功能化磁性微粒混懸液(約含微粒50 μg)，將FITC標記互補寡核苷酸探針配制為10 μmol/L應用液。共分為4個實驗組(FITC標記探針分別為50,100,150和200 pmol)和1個對照組，反應體系：FITC標記探針5～20 μL，納米微粒懸濁液 10 μL，5 mmol/L NaCl 10 μL，雜交緩沖液補足到100 μL；雜交反應管混勻后于62 ℃雜交反應30 min。反應完畢后，磁性分離，棄上清。再用清洗緩沖液充分洗滌磁微粒3次，分別用熒光顯微鏡觀察雜交前后上清液熒光信號變化及用熒光分光光度計檢測加入最適量探針各組在雜交前后熒光信號強度變化。

表1 與生物素標記探針互補的FITC標記寡核苷酸序列

2 結 果

2.1 親和素修飾納米結合生物素活性檢測 生物素加入量為40，80及100 ng時，微粒結合生物素量已趨于飽和(圖1)。因此，生物素標記辣根過氧化物酶95%被抑制點在20～40 ng(箭頭所示)。按文獻方法[4]，計算出25 μg親和素修飾納米微粒能結合生物素量為30.12 ng，每mg納米顆粒能結合生物素量約1 205 ng。

2.2 納米微粒與標記探針偶聯效率檢測 加入5，10，15和20 μL探針時上清液OD260值變化不大，但加入25 μL時，其吸光度值陡然上升，表明加入20 μL探針量已趨于飽和(圖2，紅色箭頭所示)，以此計算出親和素修飾納米顆粒最大偶聯探針量約4 000 pmol/mg[4]。納米微粒與生物素標記探針偶聯后，上清液吸光度明顯降低(表2)。按公式計算各組探針相應值：

偶聯效率=[(OD260偶聯前-OD260空白)-(OD260偶聯后-OD260空白)]/(OD260偶聯前-OD260空白)×100%

探針固定量(mol/mg)=偶聯效率×加入生物素標記探針量(mol/mg)

4組探針偶聯效率分別為78.5%，84.0%，82.8%，81.8%，計算出親和素修飾納米微粒表面能固定探針量約3.2×10-9mol/mg(以加入探針量為20 μL計算)。4組納米微粒固定探針量間均值比較，經t檢驗顯示其差別無統計學意義(P>0.05，表2)。

組 別探針1(OD260)探針2(OD260)探針3(OD260)探針4(OD260)A1．427±0．080．606±0．071．501±0．112．269±0．13B0．285±0．040．059±0．020．224±0．030．368±0．07C0．022±0．010．038±0．010．034±0．010．046±0．01

A：偶聯前； B：偶聯后； C：對照組.

2.3 cccDNA功能化納米顆粒鑒定 加入標記序列量為50 pmol和100 pmol時，雜交后上清液不能觀察到明顯熒光信號(圖3A，3B)；加入量為150 pmol時，雜交后上清液能觀察到明顯的熒光信號(圖3C)，說明其探針加入量超過功能化納米顆粒最大捕獲量。于是將100 pmol作為其最大探針捕獲量，即功能化納米顆粒對互補探針最大捕獲量大約2.0×10-9mol/mg。熒光分光度計檢測功能化納米微粒與其互補FITC標記序列雜交后各組上清液熒光強度，實驗數據見表3。從表中可見實驗各組上清液熒光強度在雜交后明顯下降，根據公式計算：

捕獲效率=[(AU雜交前-AU空白)/AU雜交前]×100%

cccDNA功能化微粒對4組不同互補序列捕獲效率均達97%以上(對照組為0.4%，探針1～4分別為97.9%，97.9%，97.7%，97.9%)。經t檢驗，各組與對照組比較，差別具有統計學意義(P<0.05)；而cccDNA功能化對4組不同互補序列捕獲效率差別不具有統計學意義(P>0.05)。同時，將已捕獲FITC互補序列的cccDNA功能化微粒懸濁液進行變性后，其上清的熒光強度又明顯上升，根據公式計算：

釋放率=[(AU變性后-AU空白)/(AU雜交前-AU雜交后)]×100%

4組微粒釋放互補序列率達80%(分別為78.1%，84.1%，78.7%，77.8%)。4組間分別進行t檢驗，其均值差別無統計學意義(P>0.05)。通過各組雜交前后及變性后上清液熒光強度檢測，表明結合有特異性cccDNA探針的磁性微粒能富集捕獲與FITC標記互補寡核苷酸序列，又能通過變性有效地釋放出保持的生物學活性游離的FITC標記寡核苷酸序列。

Tab 3 Capability of cccDNA nanoparticles to capture different complementary sequence by FITC-labeled AU

AU：吸光度單位. A:雜交前上清；B:雜交后上清；C:變性后上清.

3 討 論

由于肝細胞內cccDNA含量低，且易受同源DNA，如松弛環狀雙鏈DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)、雙鏈線性DNA (double strand linear DNA, dslDNA)、單鏈DNA(single strand DNA, ssDNA)等的干擾。因此，實現cccDNA特異和富集分離是定量檢測cccDNA的關鍵。

納米復合材料制備與應用過程的難題是納米微粒團聚，而解決團聚的有效方法是在納米微粒的表面進行如SiO2，Au，Ag等修飾。本文主要通過在SiO2修飾的磁性納米微粒表面連接具有偶聯特異性的靶向cccDNA探針來構建cccDNA功能化納米微粒，而經SiO2修飾之后，納米微粒團聚現象大大減少，有效增加了微粒表面結合親和素的能力。親和素-磁性微粒性能評價的參考方法就是親和素-納米微粒結合游離生物素的容量。用競爭抑制法對親和素-納米微粒結合生物素最大飽和結合容量分析表明，1 mg親和素修飾硅化納米顆粒能結合生物素量約為1 205 ng，與氨基修飾、Au修飾微粒結合游離生物素量基本一致[4-6]，結合量比未修飾微粒高6倍左右[5]。此外，根據rcDNA，ssDNA及dslDNA與cccDNA結構差別，設計4條長度不等的cccDNA特異性的探針序列。經親和素和生物素的相互作用，將生物素標記探針固定到磁性微粒上，通過檢測偶聯前后磁性分離上清液OD260值變化，了解納米微粒固化探針情況，判斷構建cccDNA功能化納米微粒的性能[7-8]。固定cccDNA探針前后，寡核苷酸溶液在260 nm的特征吸收峰有明顯變化且OD260值均明顯降低。通過計算，4組不同探針偶聯效率約為80%，親和素-磁性納米微粒表面能固定的寡核苷酸探針量約為3.2×10-9mol/mg，比Au、氨基修飾微粒略高(2.8×10-9mol/mg)，是未修飾微粒寡核苷酸結合能力的8倍(26 bp)[5]。將cccDNA功能化磁性微粒表面固定的探針與FITC標記互補寡核苷酸探針進行雜交反應，驗證cccDNA功能化微粒捕獲性能[9-11]。結果顯示，表面固定有探針的磁性微粒與FITC標記互補寡核苷酸探針雜交后上清液熒光明顯減弱，與完全不互補的對照序列具有非常明顯的差別，說明cccDNA功能化納米顆粒能特異性捕獲與其互補FITC標記寡核苷酸序列。通過計算，cccDNA功能微粒的最大捕獲量為2.0×10-9mol/mg，捕獲效率達97%以上。同時，cccDNA功能化微粒還能通過變性有效釋放出保持生物學活性的游離FITC標記寡核苷酸序列。

綜上所述，本研究利用磁性納米微粒的超順磁性以及親和素-生物素特異偶聯性，成功制備了cccDNA功能化納米微粒，這種新型cccDNA分離的固相載體，價格低廉且具有較高的游離生物素結合容量以及較高的寡核苷酸的結合能力。此外，本研究首次就構建cccDNA功能化微粒進行研究，但以功能化微粒為載體的新型綜合分離cccDNA技術尚需更大的樣本以進一步證實。

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(編輯:張慧茹)

Preparation and Identification for Apecific Functionalized Nanoparticles of HBV Covalently Closed Circular DNA

GUO Yongcan1, WANG Youqiang1, WEI Cong1, DENG Chong1, ZHAO Rong1, ZOU Xia1, TU Zhiguang2

1.Clinical Laboratory of Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Southwest Medical University, Luzhou 646000；2.College of Laboratory Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400016

Objective To prepare and identify specific nanoparticles of HBV cccDNA, and lay the foundation for enriching, separating, and detecting cccDNA in the future. Methods Initially, the silica-coated nanoparticles were modified by streptavidin. Then oligonucleotides for specific HBV cccDNA capture were designed and labeled by biotin. Moreover, oligonucleotides labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC), which were completely complementary to capture probe, were synthesized and captured by functionalized nanoparticles for the characteristic validation. Results Streptavidin-modified nanoparticles could bind biotin, its maximum amount was about 1 215 ng/mg. In addition, streptavidin-modified nanoparticles had a high oligonucleotides binding capacity, its average amount of nucleic acid fixed was about 3 200 pmol/mg. After FITC-labeled sequences were added to the buffer and its hybridization with functionalized nanoparticles was performed, the fluorescence intensity of supernatant was decreased noticeably compared with that of pre-hybridization. Moreover, functionalized nanoparticles could capture up to about 2 000 pmol FITC-labeled sequences. Conclusion Specific functionalized nanoparticles of cccDNA can effectively capture the complementary sequences labeled by FITC, and the capture amount is enough to capture cccDNA in routine samples.

*DNA, viral； DNA, circular； nanoparticles

2016-08-22

瀘州市重點科技計劃項目(2014-S-49)；西南醫科大學校級課題(2015-YJ028)

1.西南醫科大學 附屬中醫醫院檢驗科，瀘州 646000； 2.重慶醫科大學 檢驗醫學院，重慶 400016

郭永燦，男，(1973-)，副主任技師，醫學博士. Email：guoyongcan_2004@163.com

R342.3； R373.21； R392.11； R512.62

A

1672-4194(2016)06-0370-05