犬牙周膜細胞與骨髓基質細胞組織再生能力比較的實驗研究

黃永玲， 駱 凱， 李艷芬， 閆福華

犬牙周膜細胞與骨髓基質細胞組織再生能力比較的實驗研究

黃永玲1， 駱 凱1， 李艷芬1， 閆福華2

目的 比較犬骨髓基質細胞(BMSC)和牙周膜細胞(PDLC)體內成骨及成韌帶樣組織的能力，為牙周組織工程種子細胞的選擇提供實驗依據。 方法 將體外培養Beagle犬BMSC及PDLC與脫細胞真皮基質(ADM)膜復合后植入裸鼠皮下，以單純ADM為對照組，分別于術后4周和8周進行標本組織學及免疫組織化學染色分析，比較骨保護素(OPG)和膠原Ⅻ的表達。 結果 復合物植入4周和8周組織學觀察顯示，BMSC形成骨樣組織多于PDLC，而形成韌帶樣組織少于PDLC。免疫組織化學染色顯示，BMSC組的OPG表達量高于PDLC組，但膠原Ⅻ的表達量低于PDLC組。 結論 BMSC體內成骨能力高于PDLC組，但成韌帶樣組織能力低于PDLC組。

骨髓細胞； 牙周膜； 引導組織再生，牙周； 真皮； 細胞外基質

種子細胞是牙周組織工程學中最重要的環節，可與支架材料復合形成具有一定功能的組織，克服人造骨粉等自身無再生能力等特點，現已成為組織工程研究中的熱點。骨髓基質細胞(bone marrow stromal cell, BMSC)和牙周膜細胞(periodontal ligament cell, PDLC)是目前牙周組織工程中應用最多的種子細胞。二者在特定的環境和刺激因子作用下均有利于牙周組織的再生[1-2]。本課題組前期研究比較了二者在牙周組織再生中的潛能，實驗表明，PDLC體外成骨能力低于BMSC，但具有較高的成韌帶潛力[3]。本研究在原有研究的基礎上，比較了PDLC和BMSC體內成骨及成韌帶的能力，為篩選出較好的牙周種子細胞提供實驗依據，也有助于深入探討牙周再生治療的細胞學基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性裸鼠12只，6周齡，體質量16～18 g[許可證號：SCXK(滬)2007-0005，上海斯萊克實驗動物有限公司]。雄性Beagle犬6只，體質量10～15 kg[許可證號：SCXK(川)2007-15，四川省醫學科學院四川省人民醫院實驗動物研究所]。

1.1.2 試劑 DMEM液(美國Sigma公司)；胰酶(美國Gibco公司)；EDTA(汕頭西隴化工)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；脫細胞真皮基質(acellular dermal matrix, ADM)(北京桀亞萊福生物技術有限公司)；兔抗人骨保護素(osteoprotegerin, OPG)多克隆抗體，兔抗人膠原Ⅻ多克隆抗體(美國Santa公司)；羊抗兔超敏二步法免疫組織化學檢測試劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)；DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)。

1.1.3 儀器 石蠟組織切片機(美國Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(廣州光學儀器廠)；倒置相差熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；細胞培養箱(德國Heraeus公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSC和PDLC分離培養 (1)參照文獻[4]的全骨髓培養法培養BMSC。全麻下從6只Beagle犬的股骨近端抽取骨髓15 mL，將其注入含20 mL無血清培養基的離心管中，1 000 r/min×5 min，離心2次，置入無菌培養皿中,于培養箱中培養，2 d半量換液，5 d全量換液。以后常規每3天換液，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況及形態。細胞生長融合后，用2.5 g/L的胰酶+1 g/L的EDTA消化傳代。(2)參照文獻[5]的改良組織塊培養法培養PDLC。全麻下微創拔出Beagle犬前磨牙和磨牙，無菌條件下使用含雙抗的(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)生理鹽水反復沖洗，刮取根中1/3牙周膜，切成1 mm2左右，置入另一含無菌生理鹽水的平皿中，平鋪于用DMEM液預濕的6孔培養板底，每孔3～4塊，覆蓋25 mm×20 mm蓋玻片，各孔緩慢加入3 mL含10% FBS的DMEM液，放置于培養箱內培養。4 d后初次換液，以后常規每3天換液。待細胞生長融合后，用2.5 g/L的胰酶+1 g/L的EDTA消化傳代。

1.2.2 ADM膜與BMSC和PDLC復合物的體外構建 將1 cm×1 cm的ADM膜平均剪成4塊，將真皮面朝上，浸泡0.5 h后，置入24孔板內，將細胞密度為1×107L-1的BMSC及PDLC接種在ADM膜上，每片接種30 μL，在培養箱中孵育2 h后取出，加入800 μL 10% DMEM液，再孵育48 h[6]。

1.2.3 ADM膜與細胞復合物裸鼠皮下移植 裸鼠共12只，所有手術均于SPF級實驗室超凈臺內完成。裸鼠麻醉后消毒，在其背部前后作2個切口，分離皮下，將PDLC+ADM、BMSC+ADM以及單純ADM(真皮面朝下)植入裸鼠皮下。

1.2.4 組織學染色及免疫組織化學檢測 復合物植入裸鼠皮下4，8周時，隨機處死6只裸鼠，收集標本，4%的多聚甲醛固定，大體觀察標本，進行常規H-E染色。參照文獻[7-8]的方法進行免疫組織化學染色，檢測樣本中OPG和膠原Ⅻ的表達。使用Image Pro Plus 6.0軟件，以累積光密度(integrated optical density, IOD)/面積(area)為平均光密度值，并進行比較。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0進行統計學分析處理，平均光密度值采用t檢驗進行比較分析。P<0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 H-E染色比較 復合物植入4周時，單純ADM組可見裸鼠細胞植入ADM內部，借助其原有的膠原支架，開始“自體化”；BMSC組可見ADM內形成大量的類骨質；PDLC組可見ADM原有的膠原被新形成的結締組織包裹、替代，形成類骨質(圖1)。8周時，單純ADM組可見裸鼠細胞大面積植入ADM內，部分ADM出現完全“自體化”，未見明顯新生類骨質及膠原組織；BMSC組較4周時形成更多的類骨質；PDLC組生成大面積新生膠原組織，并逐漸替代了原有的纖維結構，與4周時無明顯差別(圖1)。

2.2 免疫組織化學染色檢測結果

2.2.1 各組膠原Ⅻ的表達情況 復合物植入4周時，膠原Ⅻ在PDLC組和BMSC組中表達均明顯，但PDLC組染色較深，表達量較多(圖2)。8周時，PDLC組膠原Ⅻ表達量仍最多(圖2)。在4周和8周時，膠原Ⅻ在單純ADM組中表達量均極少。使用獨立樣本成組t檢驗測其平均光密度值(HIS值：H=14，S及I值為0～255)，顯示PDLC組明顯高于BMSC組(P<0.05，圖3)。

2.2.2 各組OPG的表達情況 復合物植入4周時，PDLC組和BMSC組中OPG均有表達，但相比PDLC組，BMSC組表達量相對較多(圖4)。8周時， BMSC組中OPG表達量有所增加，而OPG在PDLC組中的表達量并無顯著變化(圖4)。在4周和8周時，OPG在單純ADM組中表達量仍極少。使用獨立樣本成組t檢驗測其平均光密度值(HIS值：H=12，S及I值為0～255)，顯示BMSC組OPG表達量較高(P<0.05，圖5)。

3 討 論

PDLC和BMSC是現今組織工程中應用較為廣泛的種子細胞，均具有多向分化潛能，可促進牙周組織再生[9-15]。但哪種細胞更適合作為牙周組織工程中的種子細胞尚需進一步研究明確。Tsumanuma等利用PDLC、BMSC構建細胞膜片植入牙周缺損后，發現二者均可促進牙周組織再生，PDLC組形成量較多，但二者差別無統計學意義[16]。Sun等比較PDLC及BMSC構建的細胞膜片與自體牙根體外構建牙生物性種植體，研究結果顯示，PDLC組新生的牙周組織樣結構多于BMSC組，BMSC組種植體根面多為骨性結合[17]。

本課題組前期體外實驗結果表明，BMSC體外成骨能力較PDLC強，但形成韌帶樣組織能力低于PDLC[3]。但是，細胞體內可能發生的生物學反應并不能全靠體外實驗反映出來，二者促進牙周組織再生的能力究竟有何區別，尚有待進一步研究證實。因此，本實驗將二者分別與ADM復合后植入裸鼠體內進行體內實驗，觀察二者成骨及成韌帶能力。

本次實驗選用H-E染色及OPG免疫組織化學染色的方法來研究BMSC和PDLC體內形成骨組織的能力。OPG為腫瘤壞死因子受體超家族成員，是由成骨細胞分泌表達形成的二聚體，是一種分泌型糖蛋白，可使破骨細胞失去活性從而抑制活化破骨細胞，在生理性和病理性骨吸收中均發揮著重要作用[3,18]。H-E染色及OPG免疫組織化學染色結果均表明，BMSC形成骨組織的能力要高于PDLC，這與已有的研究報道一致[3,17,19]。因此，與PDLC相比，BMSC在骨組織再生中，功能更強大。

牙周組織再生中，除了牙槽骨外，牙周韌帶的再生也是其重要組成。膠原Ⅻ屬于三聚體纖維相關膠原，主要位于膠原纖維的表層，螺旋結構，但不太規則，起著維持三維膠原纖維結構的作用[20]。Reichenberger和Karimbux等的研究均顯示，膠原Ⅻ是成熟的牙周膜形成的標記之一[21-22]。本研究結果發現，PDLC組膠原Ⅻ表達量高于BMSC組，表明PDLC的成韌帶能力高于BMSC組，這與Tsumanuma及Sun等的研究結果一致[16-17]。

以上結果分析表明，PDLC及BMSC均能在一定程度上實現牙周組織再生，但BMSC在骨組織再生中更顯其功能，PDLC在成韌帶能力方面優于BMSC。如果將2種細胞聯合用于牙周組織中，將有望最大可能地實現牙周組織的再生。

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(編輯：何佳鳳)

Comparison of Tissues Regenerative Capability between Bone Marrow Stromal Cell and Periodontal Ligament Cell on Dogs

HUANG Yongling1, LUO Kai1, LI Yanfen1, YAN Fuhua2

1. Department of Periodontology, School and Hospital of Stomatology, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, China;2. Nanjing Stomatological Hospital, Medical School of Nanjing University , Nanjing 210008, China

Objective To compare the ability of periodontal tissue regeneration between periodontal ligament cells (PDLC) and bone marrow stromal cells (BMSC), and therefore to provide experimental foundation for periodontal tissue regeneration. Methods The BMSC+ADM complex and the PDLC+ADM complex were implanted subcutaneously in nude mice. The ADM monomer was also implanted as the control group. Formed tissues specimens were harvested for histological analysis and immunohistochemistry at 4 and 8 weeks after implantation. Results After 4 weeks and 8 weeks, the result of histological analysis demonstrated that more formation of bone was observed in BMSC+ADM groups. Immunohistochemical data showed that the level of OPG in BMSC+ADM groups was higher than the one of the PDLC+ADM groups, but the expression of Collagen Ⅻ was lower than the one of the PDLC+ADM groups. Conclusions The osteogenic capacity of BMSC is higher than PDLC, but the ability of periodontal ligament formation of BMSC is lower than PDLCinvivo.

bone marrow cells; periodontal ligament; guided tissue regeneration, periodontal; dermis; extracellular matrix

R322.41； R329； R336； R781

A

1672-4194(2016)06-0365-05

2016-05-26

福建省衛生計生委青年科研課題(2015-1-65)；江蘇省“六大人才高峰”高層次人才培養項目(2013-SWYY-006)；福建省衛生系統中青年骨干人才培養項目(2015-ZQN-ZD-28)

1.福建醫科大學 附屬口腔醫院牙周科，福州 350002； 2.南京大學醫學院 附屬口腔醫院，南京 210008

黃永玲(1983-)，女，主治醫師，醫學碩士

閆福華. Email: yanfh@nju.edu.cn