IL-10拮抗Pg-LPS所致高脂血癥兔枯否氏細胞炎癥反應的實驗研究

李艷芬, 許雯靜, 吳春芳, 游曉慶, 駱 凱, 閆福華

IL-10拮抗Pg-LPS所致高脂血癥兔枯否氏細胞炎癥反應的實驗研究

李艷芬1, 許雯靜2, 吳春芳1, 游曉慶1, 駱 凱1, 閆福華3

目的 探討白細胞介素-10(IL-10)對牙齦卟啉單胞菌脂多糖(Pg-LPS)引起的高脂血癥兔肝臟枯否氏細胞(KC)炎癥反應的影響。 方法 健康新西蘭兔12只隨機分為2組，分別喂予基礎飼料和高脂飼料。喂養6周后建立高脂血癥模型。分離、收集KC，將正常和高脂組KC隨機分為：對照組、Pg-LPS組(1 μg/mLPg-LPS刺激)、IL-10+Pg-LPS組(0.1 μg/mL IL-10+1 μg/mLPg-LPS刺激)。刺激24 h后，采用Griess法檢測NO，Western-blot法檢測NF-κB p65及IκB-α，DCFH-DA熒光檢測細胞內ROS的表達。 結果 對照組中高脂KC的NF-κB p65蛋白及NO，ROS水平均高于正常KC。Pg-LPS作用后，正常及高脂KC的炎癥物質表達量升高，且高脂血癥與Pg-LPS呈協同作用。IL-10的干預處理使NO，ROS，NF- κB p65表達下降，IκB-α表達升高，對Pg-LPS所引起的炎癥反應起抑制作用，對高脂KC的抑制作用更加明顯。 結論 高脂血癥可使KC處于相對激活狀態。在牙周致病菌Pg-LPS作用下，高脂血癥和Pg-LPS具有協同作用，IL-10可抑制Pg-LPS所致KC的炎性反應，且對高脂狀態下KC的干預作用更佳。

*卟啉單胞菌, 牙髓； 脂多糖類； 白細胞介素10； 高脂血癥； 炎癥

高脂血癥(hyperlipemia, HL)又稱為血脂異常，是一種全身性疾病。在HL狀態下，過多的脂質沉積于血管內皮，激活全身的單核/巨噬細胞系統，并吞噬脂質形成大量泡沫細胞，從而導致動脈粥樣硬化和脂肪肝等病理性改變[1]。非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)是一種無過量飲酒、以肝實質細胞脂肪變及脂肪儲積為特征的臨床病理綜合征，其發病率隨著肥胖、HL群體的迅速增長而明顯增高。枯否氏細胞(Kuffer cell，KC)是肝內固有的巨噬細胞，占全身單核/巨噬細胞總量的80%～90%，是NASH發生發展中重要的免疫細胞[2]。KC受誘導激活后可大量釋放炎癥因子，在脂肪肝到NASH的發展中起重要作用，也是誘發進展性肝纖維化的關鍵因素[3]。研究發現，牙周炎患者高水平的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可激活巨噬細胞的聚集，通過低密度脂蛋白形成泡沫細胞[4]。該結果提示牙周炎、HL、單核/巨噬細胞三者之間可能存在一定聯系。白細胞介素-10(interleutin-10，IL-10)是一種免疫調節因子，具有潛在的抗炎和免疫抑制功能[5]。本研究擬通過檢測牙齦卟啉單胞菌脂多糖(porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,Pg-LPS)作用下KC中一氧化氮(nitric oxide, NO)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、核因子-κp p65(nuclear factor-κp p65, NF-κp p65)和IκB-α的表達變化以及IL-10對其調控作用，以期為研究牙周病和肝臟疾病間的相關性提供新的細胞學證據。

1 材料與方法

1.1 動物 健康新西蘭兔12只[中科院上海研究所動物中心，合格證號：SCXK(滬)2007-0007],(2.5±0.5)kg，雌雄不限,喂養于中國人民解放軍南京軍區福州總醫院比較醫學科。

1.2 試劑及儀器 RPMI-1640培養液(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；Ⅰ型膠原酶(美國Gibco公司)；Pg-LPS(美國Invitrogen公司)；DCFH-DA(美國Sigma公司)；IL-10(美國Pepro tech公司)；NO檢測試劑盒(武漢碧云天生物技術公司)；兔抗兔NF-κB p65一抗(美國Abcam公司)；兔抗兔IκB-α一抗(武漢博士德生物公司)；冷凍高速離心機(德國Heraeus公司)；熒光倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 HL新西蘭兔模型的建立 新西蘭兔12只分籠飼養于20 ℃、70%濕度環境。適應性喂養1周后，隨機分為2組。對照組予以基礎飼料喂養，高脂組參照文獻[6]喂以高脂飼料，配方：基礎飼料+1%膽固醇+5%豬油+15%鮮蛋黃，每日喂養量控制為每只150～200 g，連續喂養6周。滿6周后抽取耳緣靜脈血，檢測總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)。

1.3.2 細胞的收集、純化、培養 參照文獻[7]的方法，禁食12 h后，戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉下，分離結扎肝門靜脈和下腔靜脈遠心端，在下腔靜脈近心端插管，引流肝內血液。在肝門靜脈入肝處灌注4 ℃預冷的含肝素鈉的D-Hank’s液，至肝內血液流出為土黃色，切下約4 g肝臟，剪碎至1 mm3大小，加入消化液(含0.005%DNase I、 0.1% Ⅰ型膠原酶的D-Hank’s液)，37 ℃水浴震蕩消化30 min，200目細胞篩過濾2次，4 ℃、2 200 r/min離心10 min，棄上清，無血清RPMI 1640洗滌細胞沉淀2次后，重懸，加入含70%和30%梯度的percoll液，4 ℃、2 000 r/min離心25 min，吸取中間的云霧層，即為KC，加入含20%胎牛血清的RPMI 1640培養液，接種，2 h后洗去非貼壁細胞，以巨噬細胞特異性抗體Macrophagemarker(MAC387)行免疫細胞化學鑒定，臺盼藍染色檢測細胞存活率，存活率>95%可用。

1.3.3 實驗分組及細胞處理 按不同檢測方法的要求，將6只健康和6只高脂兔KC用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液調整細胞密度進行接種，接種24 h后更換含1%胎牛血清的RPMI 1640培養液培養2 h使其同步化。

實驗分3組：對照組、1 μg/mLPg-LPS組、0.1 μg/mL IL-10+1 μg/mLPg-LPS組。參照文獻[8-9]，對照組僅加入10%胎牛血清的RPMI 1640培養液；IL-10組先加入IL-10，使其終濃度為0.1 μg/mL，2 h后IL-10+Pg-LPS組和Pg-LPS組再分別加入Pg-LPS，使其終濃度為1 μg/mL。

1.3.4 采用Griess法檢測NO 調整細胞密度為1×106mL-1，接種于6孔板，每孔1 mL。24 h后加藥處理，繼續培養24 h后，經0.02%EDTA+0.25%胰酶消化，收集細胞，離心后吸取50 μL上清于96孔細胞培養板中，BCA法進行蛋白定量，按Griess試劑盒說明書用酶標儀于波長540 nm測定吸光度，同時繪制標準曲線并計算得出個組產生的NO量。結果以NO濃度/蛋白含量比值表示。

1.3.5 DCFH-DA熒光檢測細胞內ROS含量 調整細胞密度為2×105mL-1，接種于12孔板，每孔1 mL。24 h后，加藥處理，繼續培養24 h后，經0.02%EDTA+0.25%胰酶消化，調整細胞濃度為2×105mL-1，加入500 μL終濃度為10 μmol/L DCFH-DA，充分混勻，在37 ℃條件下避光反應30 min。PBS緩沖液洗滌細胞3次，1 mL PBS重懸，熒光分光光度計檢測熒光強度，激發波長488 nm，發射波長525 nm。

1.3.6 Western-blot法檢測NF-κB p65及IκB-α表達水平 調整細胞密度為1×106mL-1，接種于直徑60 mm培養皿，每皿3 mL。24 h后加藥處理并繼續培養24 h。PBS緩沖液洗滌細胞1次，用細胞刮子收集細胞，PBS緩沖液洗滌細胞2次。采用胞核/胞質蛋白提取試劑盒提取KC的胞質蛋白和胞核蛋白，并分裝于-80 ℃凍存備用。用BCA法蛋白定量并配平各上清液濃度。取配平后的各上清液80 μL，100 ℃、10 min變性后，經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕法轉膜，將蛋白轉移至0.45 μm孔徑PVDF膜，5%脫脂奶粉、37 ℃封閉1 h后，分別加入1∶200的NF-κB p65一抗、1∶200的IκB-α一抗、1∶300的鼠抗兔GAPDH一抗和1∶300的兔抗兔β-actin一抗，4 ℃孵育過夜后用1∶5 000辣根過氧化物酶HRP標記羊抗鼠二抗及辣根過氧化物酶HRP標記羊抗兔二抗，37 ℃輕搖1 h，化學發光法顯色，膠片曝光。通過Quantity One 4.6.2進行灰度值定量，以各組KC中NF-κB p65/GAPDH、IκB-α/β-actin掃描灰度值計算各組細胞中NF-κB p65及IκB-α的相對表達水平。實驗重復3次。

2 結 果

2.1 血脂檢測結果 第6周時，高脂組的TC，TG，HDL-C及LDL-C均明顯高于對照組，差別具有統計學意義(P<0.05)。參照HL的診斷標準[10]，表明在第6周時，新西蘭兔HL動物模型已成功建立(表1)。

2.2 KC細胞鑒定 免疫細胞化學染色顯示KC中MAC387呈陽性表達(圖1)。

表1 血脂水平比較

n=6. TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；HDL-C：高密度脂蛋白；LDL-C：低密度脂蛋白. 與對照組比較，△:P<0.05.

2.3 不同處理方式對KC分泌NO的影響 按照Griess試劑盒的說明書繪制標準曲線，計算各不同處理組相對NO含量。對照組中高脂KC的NO分泌量顯著高于正常KC的分泌量(P<0.05)。加入Pg-LPS刺激后，高脂及正常KC的NO分泌量均顯著上升(P<0.05)，且高脂KC的NO分泌量高于正常KC，提示高脂和Pg-LPS呈現疊加作用。IL-10對Pg-LPS引起正常KC和高脂KC的炎癥反應具有抑制作用，NO分泌量均降至接近正常對照組水平，顯著低于對照組中高脂KC的分泌量(P<0.05，圖2)。

2.4 不同處理方式對KC中ROS含量的影響 DCFH-DA染色后，熒光酶標儀檢測結果表明，Pg-LPS的刺激可使KC中ROS的含量顯著上升(P<0.05)。IL-10作用后ROS含量均顯著下降(P<0.05)。對照組中高脂KC的ROS表達較正常KC顯著升高(P<0.05)。在Pg-LPS刺激后，ROS升高尤為明顯，高于同組中正常KC的表達量(P<0.05，圖3)。

2.5 不同處理方式對KC中NF-κB p65及IκB-α表達水平的影響 Western-blot法檢測結果表明，Pg-LPS刺激下正常KC中NF-κB p65及IκB-α表達水平與對照組中正常KC比較無統計學差別；IL-10干預后，與對照組中正常KC比較，NF-κB p65表達水平顯著下降(P<0.05)，IκB-α表達水平顯著上升(P<0.05)。對照組中高脂KC的NF-κB p65表達水平比正常KC的表達顯著上升(P<0.05)，加入Pg-LPS后高脂KC中NF-κB p65的表達水平顯著高于對照組中高脂KC的表達，也高于Pg-LPS作用后正常KC的表達(P<0.05)；加入IL-10后，炎癥被明顯抑制，降至對照組正常KC水平(P<0.05)。對照組中高脂KC的IκB-α表達水平與正常KC比較無統計學差別，Pg-LPS刺激后高脂KC的IκB-α表達水平顯著下降(P<0.05)；IL-10干預后，高脂及正常KC的IκB-α表達水平與對照組比較均顯著上升，且高脂KC的表達水平顯著低于正常KC(P<0.05，圖4，5)。

3 討 論

HL是指脂質代謝或轉運異常伴血脂水平過高，可直接引起一些嚴重危害人體健康的疾病。研究顯示，HL狀態下，血液中IL-6,IL-8等炎癥因子的水平升高，與動脈粥樣硬化等多種全身性疾病密切相關[11]。相關機制可能是：HL時，為清除過多的脂質，全身單核/巨噬細胞大量增生，功能紊亂，導致對LPS敏感性上調，炎癥因子表達增加[12]。活化后的巨噬細胞可分泌多種生物活性物質，如ROS,NO,IL-1等。其中NO和ROS具有多種生物學功能[13]，是重要的免疫調節因子，還具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌等活性。研究發現，NO與炎癥損傷的多個致病環節密切相關[14]。巨噬細胞在受到免疫或炎癥刺激可合成誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)產生大量NO，并與超氧陰離子等氧自由基反應，增加了其對組織細胞的細胞毒性效應[15]。高水平的ROS能誘導氧化應激和炎性反應，進而導致生化與生理損傷[16]。NF-κB是一類重要的轉錄激活因子，在許多腫瘤性疾病和炎癥中，NF-κB表達增強，從而調節許多與免疫功能和炎癥有關的基因[17]。NF-κB主要由P50和P65兩亞基組成，在細胞靜息狀態時與抑制因子IκB結合，形成NF-κB/IκB復合體，使NF-κB以無活性的形式存在于細胞質中，一旦被胞外刺激信號刺激后，IκB激酶激活，IκB蛋白磷酸化并被蛋白酶降解，NF-κB與IκB解離，活化的NF-κB轉入核內調控基因表達[18]。IκB的降解程度可決定NF-κB的活化水平，IκB的含量與NF-κB的活化水平成反比。研究發現，ROS可通過細胞信號系統調控，活化NF-κB p65-P50異源二聚體，從而激活NF-κB[19]。何姜等研究發現，NF-κB p65蛋白表達的增加會導致iNOS表達增加，從而引起細胞NO水平升高[20]。本研究發現，對照組中高脂KC的NF-κB p65蛋白及NO,ROS水平均高于正常KC，提示HL新西蘭兔KC處于一種相對激活狀態，與之前研究結果相符。

Pg-LPS可通過與單核/巨噬細胞表面的受體結合，使宿主免疫體系激活，引起全身的炎癥反應。研究表明，LPS通過Toll受體、MD2及CD14等膜表面受體與KC結合[21]，誘導NF-κB及AP-1等磷酸化和核移位[22]，KC激活后釋放氧化亞氮、超氧負離子等活性氮的中間產物，活性脂質、細胞因子等免疫反應所必需的介質，而這些介質的過多釋放將導致細胞的壞死和組織的損傷[23]。本研究觀察到，在Pg-LPS刺激下，不僅正常KC的ROS,NO表達量與對照組中正常KC顯著升高，高脂KC的ROS,NO,NF-κB p65表達量與對照組中高脂KC比較，也顯著升高。同時，IκB-α的表達量卻顯著下降，且上述結果與Pg-LPS刺激下正常KC比較，差別也有統計學意義。Pg-LPS+高脂KC組表達量變化與對照組、Pg-LPS+正常KC組比較，差別也有統計學意義(P<0.05)，說明牙周致病菌Pg-LPS對KC有誘導活化作用，使其分泌的炎癥介質增加。HL和Pg-LPS對KC的誘導活化作用具有協同作用，提示患有牙周炎的HL患者罹患NASH的風險可能要大于單純的牙周炎患者和HL患者。

IL-10具有抗炎和免疫抑制作用，在巨噬細胞和T細胞介導的急性肝損傷中具有顯著的肝臟保護作用[24]。夏陽等研究表明，IL-10可以抑制由TNF-α誘導的肝星狀細胞激活，在肝臟早期炎癥和肝纖維化進程中起保護作用[25]。本實驗結果表明，0.1 μg/mL IL-10對Pg-LPS所引起的正常和HL新西蘭兔KC的炎癥反應都起到抑制作用，并且對HL新西蘭兔炎癥介質下調的幅度明顯大于正常新西蘭兔，提示外源性的IL-10對KC活化后誘導的炎癥反應起抑制作用，有利于保護肝臟的正常組織、細胞和功能，且可能對HL患者的肝臟保護效果更顯著。

綜上所述，Pg-LPS能有效地誘導KC活化，從而引起一系列炎癥介質、生物活性物質等的表達和釋放，對肝的正常組織細胞產生損害，特別是HL的患者，加大其罹患NASH的風險。IL-10能有效地降低Pg-LPS所產生的炎癥反應，且對HL個體的炎癥抑制作用更加明顯。研究結果可能為深入探討牙周病與肝臟疾病的關系和防治方法提供新的細胞學證據。

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(編輯:張慧茹)

Experimental Study of IL-10 anta Ponizing Inflammatory Reaction of Kuffer Cell Induced byPg-LPS in Hyperlipidemia Rabbit

LI Yanfen1, XU Wenjing2,WU Chunfang1, YOU Xiaoqing1, LUO Kai1,YAN Fuhua3

1.Department of Periodontology,School and Hospital of Stomatology, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, China;2.Department of Stomatology, People’s Hospital of Fujian Province, Fuzhou 350004, China;3. Nanjing Stomatological Hospital, Medical School of Nanjing University, Nanjing 210008, China

Objective To explore the effect of interleukin-10 on inflammatory reaction of Kuffer cell following thePg-LPS stimulation in hyperlipidemia rabbit. Methods 12 New Zealand rabbits were randomly divided into two groups and were fed with normal or high fat diet. The hyperlipidemia model was established 6 weeks later. We isolated and cultured the Kuffer cells (KC). Both normal and hyperlipidemia group were divided into 3 groups: control,Pg-LPS at 1 μg/mL, andPg-LPS at 0.1 μg/mL IL-10+1 μg/mL. After the treatment for 24 h, NO levels were detected by Griess assay. NF-κB p65 and IκB-α fragment were inspected by Western blot. ROS levels were determined by fluorescence enzyme-labelled meter with DCFH-DA as fluorescent probe. Results The levels of NF-κB p65,NO and ROS were higher in hyperlipidemia control group than in normal control group. After being stimulated byPg-LPS, the expression of inflammatory substances was increased indicating a synergistic effect between hyperlipidemia andPg-LPS. Under the IL-10 treatment the expression of NO,ROS,NF-κB p65 were decreased, while the expression of IκB-α was increased. IL-10 inhibited the inflammatory reaction induced byPg-LPS, and the inhibition was more significant in the KC of hyperlipidemia rabbit. Conclusion The KC of hyperlipidemia rabbit is in a relatively activated condition, after being stimulated byPg-LPS, hyperlipidemia andPg-LPS present a synergistic effect. IL-10 can inhibit the inflammatory reaction of KC after thePg-LPS stimulation, and the effect is better for the KC with hyperlipidemia.

porphyromonas endodontalis； lipopolysaccharides； interleukin-10； hyperlipidemias； inflammation

2016-08-22

國家自然科學基金(30973326)；福建省自然科學基金(2013J01306)；福建省教育廳科研基金(JA11123)

1.福建醫科大學 附屬口腔醫院牙周科，福州 350002; 2.福建省人民醫院 口腔科，福州 350004; 3.南京大學醫學院 附屬口腔醫院，南京 210008

李艷芬(1979-),女,副主任醫師，醫學博士

閆福華. Email: fhyan2005@126.com

R332； R378.84； R392.12； R977

A

1672-4194(2016)06-0359-06