HBx通過Wnt/β-catenin通路促進HepG2細胞增殖

鄭碧云， 方雪芬， 陳治新， 高雯宇， 李 丹， 王小眾

HBx通過Wnt/β-catenin通路促進HepG2細胞增殖

鄭碧云， 方雪芬， 陳治新， 高雯宇， 李 丹， 王小眾

目的 探討Wnt/β-catenin通路在穩定表達乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)的HepG2肝癌細胞增殖中的作用機制。 方法 驗證前期構建的HepG2/HBx細胞株能穩定表達HBx蛋白。CCK-8法檢測HepG2/HBx，HepG2/mock及HepG2 3組細胞增殖情況，RT-PCR及Western-blot法分別檢測上述3種細胞中β-catenin mRNA和蛋白表達水平；最后檢測β-catenin選擇性抑制劑XAV939(20 μmol/L)對各組細胞增殖水平的影響。 結果 前期構建的HepG2/HBx 細胞株能穩定表達HBx蛋白。細胞增殖實驗表明，HepG2/HBx組細胞增殖能力強于對照組(P<0.05)。RT-PCR及Western-blot檢測結果顯示，HepG2/HBx組細胞中β-catenin的 mRNA及蛋白表達水平均高于對照組(P<0.05)，而HepG2/mock及HepG2組細胞之間則無明顯差別。XAV939能夠抑制各組細胞的增殖能力，HepG2/HBx組細胞在加入20 μmol/L XAV939作用后的增殖速度較加入相同濃度DMSO的HepG2/HBx組細胞下降(P<0.05)。XAV939對HepG2/HBx組細胞增殖的抑制強于對照組。 結論 HBx蛋白可以上調肝細胞β-catenin表達，激活Wnt/β-catenin通路，促進肝癌細胞增殖。選擇性β-catenin抑制劑可部分逆轉該作用。

病毒蛋白質類； 乙型肝炎病毒x蛋白； 細胞增殖； 反式激活因子類； 原癌基因

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是全球主要的人類病原體之一，它的慢性感染將導致一系列肝臟疾病的發生，包括肝炎、肝硬化和肝細胞癌。在HBV編碼的蛋白質中，HBx蛋白被稱為“病毒癌蛋白”，它能促進細胞增殖，與宿主因素之間相互作用促進了HBV相關的肝細胞癌的發生和發展[1-3]。近年來，越來越多的研究關注到Wnt/β-catenin信號通路。它在細胞增殖、分化、癌變中同樣起著重要角色，與肝癌、結腸癌等多種腫瘤的發生、發展密切相關[4]。因此，Wnt/β-catenin信號通路可能在HBV感染慢性化以及肝癌發生發展過程中起作用。本研究以前期構建好的穩定表達HBx蛋白的HepG2/HBx肝癌細胞為研究對象，觀察其增殖情況以及細胞β-catenin mRNA和蛋白表達水平，然后加入β-catenin選擇性抑制劑XAV939，觀察其對肝癌細胞增殖的影響，初步探討Wnt/β-catenin在穩定表達HBx蛋白的HepG2/HBx肝癌細胞增殖中的作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 HepG2/HBx細胞(轉染重組HBx慢病毒載體的HepG2肝癌細胞)、HepG2/mock細胞(轉染慢病毒空載體的HepG2肝癌細胞)、HepG2細胞均由本實驗室前期構建與凍存[5]。

1.1.2 試劑 小鼠抗人Flag 單克隆抗體(美國Abmart公司)；小鼠抗人β-catenin一抗、小鼠抗人β-actin 單克隆抗體、兔抗小鼠二抗、蛋白印跡實驗的ECL顯色試劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)；XAV939(美國Selleck Chemicals公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8，日本DOJINDO公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；RT-PCR試劑盒(美國Thermo公司)；100 bp DNA Ladder(加拿大Fermentas公司)；BCA蛋白定量試劑盒、哺乳動物細胞總蛋白抽提試劑(碧云天生物科技有限公司)。

1.1.3 儀器 PCR儀(AB2720型，美國AB公司)；穩壓穩流電泳儀(DYY-5型，北京六一儀器廠)；蛋白電泳及轉印設備(美國Bio-Rad公司);倒置相差熒光顯微鏡(TE2000-U，日本尼康公司);凝膠成像儀Tanon-2500(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 驗證前期凍存的HepG2/HBx細胞穩定表達HBx基因

1.2.1.1 倒置熒光顯微鏡觀察HepG2/HBx細胞株GFP蛋白表達情況 重組慢病毒載體攜帶GFP基因，能表達GFP蛋白，在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光。將HepG2/HBx細胞、HepG2/mock細胞、HepG2細胞從液氮罐中取出復蘇，用含10%胎牛血清的DMEM的培養基培養細胞，待長至80%左右，熒光顯微鏡下觀察各組細胞GFP表達情況。

1.2.1.2 RT-PCR法鑒定HepG2/HBx細胞株的HBx mRNA表達情況 培養HepG2/HBx，HepG2/mock及HepG2 3組細胞，待細胞貼壁長至80%融合后收集細胞，提取各組細胞總RNA，合成cDNA，PCR擴增所需HBx基因片段(產物大小465 bp)：

上游引物：5′ATG CAA GCT TAT GGC TGC TAG GCT GTA CTG 3′

下游引物：5′TGC GAA TTC TTA GGC AGA GTG AAA AAG TTG 3′

PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min→94 ℃變性45 s→61 ℃退火30 s→72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃延伸7 min。取 8 μL RT-PCR產物與2 μL的5×Loading Buffer混合均勻，在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，恒壓100 V電泳30 min，在紫外燈下觀察結果并照相。

1.2.1.3 Western-blot 法鑒定HepG2/HBx細胞株的HBx蛋白表達情況 培養HepG2/HBx，HepG2/mock及HepG2 3組細胞，待細胞貼壁長至80%融合后收集細胞，分別加入1 mmol/L PMSF的細胞裂解液裂解細胞，收集蛋白。經過BCA蛋白定量、變性、12%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉印至NC膜、脫脂奶粉封閉后，分別與小鼠抗人flag一抗(1∶1 000)及鼠抗人β-actin 單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，洗滌后再分別與山羊抗小鼠二抗(1∶2 000)、兔抗小鼠二抗(1∶2 500)作用l h，經ECL底物化學發光顯影，掃描為圖片，經Image J軟件測量膠片中條帶灰度值。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖活性 取對數期生長的HepG2/HBx，HepG2/mock及HepG2 3組細胞，經0.25%的胰蛋白酶消化，配成單個細胞懸液，按每孔100 μL、3×103細胞接種于96孔板，并設6個復孔，于37 ℃、體積分數為0.05的CO2培養箱中培養。分別于培養1,2及3 d后，取出96孔板，棄去原有培養液，用PBS洗滌后，加入CCK-8試劑與培養基的混合液，比例為CCK-8∶培養基=10 μL∶100 μL，于37 ℃、體積分數為0.05的CO2培養箱培養3 h后，在波長450 nm下檢測每孔的吸光值(OD)。根據吸光值繪制生長曲線，比較各組細胞生長速度變化。實驗重復3次。

1.2.3 RT-PCR法檢測細胞β-catenin mRNA表達 培養HepG2/HBx，HepG2/mock及HepG2 3組細胞，待細胞貼壁長至80%融合后收集細胞，提取各組細胞RNA，合成cDNA，PCR擴增所需β-catenin基因片段(產物大小533 bp)：

上游引物：5′AAA TGG TTG CCT TGC TCA AC 3′

下游引物：5′TCA GCA CTC TGC TTG TGG TC 3′

PCR反應條件：94 ℃預變性3 min→94 ℃變性45 s→58 ℃退火30 s→72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃延伸7 min。取8 μL RT-PCR 產物與2 μL的5×Loading Buffer混合均勻，加在12 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 g/L Goodview)上進行電泳，恒壓100 V電泳20 min，在紫外燈下觀察結果并照相。

1.2.4 Western-blot法檢測細胞β-catenin蛋白表達 培養HepG2/HBx，HepG2/mock及HepG2 3組細胞，待細胞貼壁長至80%融合后收集細胞，分別加入1 mmol/L PMSF的細胞裂解液裂解細胞，收集蛋白。經過BCA蛋白定量、變性、12%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉印至NC膜、脫脂奶粉封閉后，分別與小鼠抗人β-catenin單克隆抗體(1∶1 000)及小鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000)在4 ℃條件下孵育過夜，再與兔抗小鼠二抗(1∶2 500)作用1 h。經ECL底物化學發光顯影，掃描為圖片，經Image J軟件測量膠片中條帶灰度值。

1.2.5 XAV939對細胞增殖的影響 HepG2/HBx，HepG2/mock及HepG2細胞培養法同上，待細胞貼壁后，吸出原培養基，3組細胞分別加入含20 μmol/L XAV939的培養基100 μL培養24 h，另外以相同體積含DMSO(最終濃度<0.3%)但不含XAV939的培養基設為對照組培養24 h。經0.25%的胰蛋白酶消化，用CCK-8法檢測細胞增殖(方法同上述)。實驗重復3次。利用OD值計算細胞增殖抑制率：

抑制率(%)=(1-OD實驗組/OD對照組)×100%

1.3 統計學處理 RT-PCR凝膠電泳以及Western-blot圖片采用Image J圖像分析軟件進行掃描分析，獲得灰度值數據，經過內參照β-actin條帶灰度進行校正，校正灰度值以mean±SD表示。利用SPSS 13.0統計軟件處理，采用單因素ANOVA進行顯著性檢驗，P<0.05為差別具有統計學意義。

2 結 果

2.1 前期凍存的HepG2/HBx細胞能穩定表達HBX基因 倒置熒光顯微鏡下可見新復蘇的HepG2/HBx細胞株能產生綠色熒光(圖1A)，僅有HepG2/HBx細胞有HBX基因mRNA表達(大小約465 bp)與HBx蛋白表達(大小約17 kD)，而感染空載病毒的HepG2/mock細胞與對照組HepG2細胞不表達HBX基因mRNA與HBx蛋白(圖1Ba,b)。由此可見，本實驗室前期凍存的HepG2/HBx細胞株依然能夠持續穩定表達HBX基因。

2.2 HBx蛋白促進HepG2細胞增殖 CCK-8檢測3組細胞增殖能力情況。在第1，2及3天HepG2/HBx細胞組的增殖速度較HepG2/mock組與HepG2組升高，差別具有統計學意義(P<0.05)(圖2)，這與前期在穩定表達HBx的正常肝細胞HL7702中的研究結果一致[6]。

2.3 HBx蛋白上調HepG2細胞β-catenin mRNA與蛋白表達水平 HepG2/HBx,HepG2/mock及HepG2 3組細胞β-catenin mRNA/β-actin mRNA的相對灰度比值分別為(2.846 6±0.284 2)，(1.784 8±0.285 4)及(1.070 3±0.657 8)。統計學分析顯示，HepG2/HBx組中β-catenin mRNA較HepG2/mock組及HepG2組升高(圖3)，差別具有統計學意義(P<0.05)。

Western-blot提示，各組細胞均有β-catenin蛋白表達(圖3Ba)。經灰度值掃描對比分析顯示，HepG2/HBx，HepG2/mock及HepG2 3組細胞β-catenin/β-actin蛋白的相對灰度比值分別為(0.739 5±0.026 4),(0.536 1±0.033 5),(0.552 7±0.042 5)。統計學分析提示，HepG2/HBx組中β-catenin蛋白水平較HepG2/mock組及HepG2組升高(圖3Bb)，差別具有統計學意義(P<0.05)。

2.4 加入β-catenin抑制劑XAV939后HepG2/HBx細胞增殖活性 經20 μmol/L XAV939的培養液培養24 h后，6組細胞增殖能力情況如圖4所示。統計學分析提示，XAV939能夠抑制各組細胞的增殖，HepG2/HBx組細胞在加入20 μmol/L XAV939的培養液培養24 h后繼續培養1，2及3 d 的增殖速度較未加藥的HepG2/HBx組下降，差別具有統計學意義(P<0.05)。XAV939對HepG2/HBx組細胞的增殖抑制作用高于HepG2/mock及HepG2組，差別具有統計學意義(P<0.05，表1)。

Tab 1 Detection of the proliferation inhibition rate of HepG2/HBx, HepG2/mock and HepG2 cells treated with XAV939

分 組t/d123HepG2/HBx0．3086±0．0212△0．3537±0．0274△0．4108±0．0129△HepG2/mock0．1923±0．01990．2235±0．02220．2887±0．0336HepG20．1887±0．01360．2029±0．03200．2960±0．0632

n=6. 與HepG2/mock及HepG2組比較，△:P<0.05.

3 討 論

目前全球肝細胞癌的年發病數為75萬，是僅次于肺癌的癌癥致死原因。其中HBV感染者占大約二分之一。HBx蛋白是一種多功能蛋白，它能調節轉錄、信號轉導通路、氧化應激、細胞增殖、細胞周期進程、DNA修復等，促進了HBV相關的肝細胞癌的發生和發展[1-2,7]，然而其具體作用機制尚未完全明確，可能涉及多個關鍵分子與信號轉導通路。研究發現，HBx蛋白通過與Akt相互作用，促進了細胞增殖并導致其往致瘤性轉化[8]；還有學者指出，HBx蛋白能夠依賴胞內鈣信號調控細胞周期調節蛋白的表達、亦能調控LASP-1蛋白的表達促進細胞的增殖[9-10]。而本研究通過CCK-8實驗也發現，HBx蛋白可促進HepG2肝癌細胞的增殖，支持以上的觀點。

Wnt/β-catenin信號轉導通路參與了多種生理過程、胚胎發育和癌癥的發生，它的異常活化通過促進細胞增殖、調節血管生成因子如MMP-2，VEGF-A的水平導致肝細胞癌的發生與發展、侵襲與轉移[11]。Wnt與受體復合物結合后被激活，抑制下游蛋白質復合物，包括AXIN，GSK-3與APC蛋白，從而激活β-catenin。Shen等研究發現，在肝祖細胞中，HBx蛋白能上調β-catenin的表達，抑制細胞凋亡[12]。本研究也發現，在穩定表達HBx的HepG2細胞中，β-catenin的mRNA和蛋白表達水平都上調了，這說明了Wnt/β-catenin信號轉導通路在HepG2/HBx細胞中激活了，β-catenin是Wnt信號通路的一個關鍵組成部分，其易位至細胞核將發起下游靶基因的轉錄，比如c-myc基因和cyclinD1的轉錄[13]，由此可見，β-catenin是否易位至細胞核并發起下游靶基因的轉錄是后續研究的方向。而為進一步探討β-catenin的表達上調與HBx蛋白促進HepG2細胞增殖的關系，本研究加入了β-catenin選擇性抑制劑XAV939進行干預后再檢測細胞增殖的變化。結果提示，XAV939干預后細胞增殖受到抑制，尤其是在高表達HBx蛋白的HepG2/HBx組，增殖抑制率更加明顯，這預示著HepG2/HBx組細胞中β-catenin的表達上調與HBx蛋白促進HepG2細胞增殖的作用密切相關。

XAV939是端錨聚合酶1(TNKS1)以及端錨聚合酶2(TNKS2)蛋白的抑制劑，它通過穩定AXIN的水平下調β-catenin的表達與活性，因此端錨聚合酶被認定為抗腫瘤分子治療的候選目標之一[14]，而學者們也對XAV939抗癌作用展開了研究，發現其在結腸癌、乳腺癌中都發揮了抗癌效應[15]。本研究發現，當加入XAV939后，HepG2/HBx細胞的增殖速率下降了。基于Wnt/β-catenin信號轉導通路在肝細胞癌的發病機制中起到的重要作用，筆者推測端錨聚合酶抑制劑將對HBV相關性肝細胞癌的治療有潛在的臨床應用前景，而這有待進一步更深入的研究證實。

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(編輯:張慧茹)

Hepatitis B Virus x Protein (HBx) Enhanced the Proliferation of HepG2 Cells Through Wnt/β-catenin Pathway

ZHENG Biyun, FANG Xuefen, CHEN Zhixin, GAO Wenyu, LI Dan, WANG Xiaozhong

Department of Gastroenterology, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China

Objective To observe the effect of Wnt/β-catenin pathway on the proliferation of HepG2 cells expressing hepatitis B virus x protein (HBx) stably. Methods We verified that HepG2/HBx cell lines constructed previously in our lab could stably express HBx protein. Then, cell-counting Kit-8 (CCK-8) assay was used to detect the proliferation of HepG2/HBx, HepG2/mock and HepG2 cells. RT-PCR and Western-bolt were used to examine the level of β-catenin mRNA and protein expression in cells of the three cell groups. Finally, the level of cell proliferation was measured respectively aftertreated with 20 μmol/L β-catenin selective inhibitor XAV939 for 24 h. Results HepG2/HBx cell lines constructed previously in our lab could stably expressing HBx protein. CCK-8 assay displayed that the proliferation rate of HepG2/HBx was higher than that of HepG2/mock and HepG2 cells．The level of β-catenin mRNA and protein expression was greater in HepG2/HBx cells compared with that of HepG2/mock and HepG2 cells(P<0.05)． β-catenin selective inhibitor XAV939 suppressed cell growth of the three groups. HepG2/HBx cells with XAV939 showed lower proliferation rate than that with DMSO. The proliferation inhibition rate of HepG2/HBx cells was significantly higher than that of other two groups at three time points(P<0.05)． Conclusion The results indicate that HBx up-regulates β-catenin expression to activate wnt/β-catenin pathway and then promotes HepG2 cells proliferation.

viral proteins； hepatitis B virus； cell proliferation； trans-activators； proto-oncogene

2016-06-12

國家自然科學基金青年項目(81300321)；福建省財政專項經費(閩財指[2015]1297號)；福建省自然科學基金青年項目(2016J05189)；福建省衛計委中青年骨干重點項目(2014-ZQN-ZD-9)；福建省臨床醫學重點專科資助項目(閩衛科教[2012]149號)

福建醫科大學 附屬協和醫院消化科，福州 350001

鄭碧云(1986-)，女，住院醫師，醫學博士

王小眾．Email：drwangxz@163.com

R341； R345； R394.2； R730.2； R735.7； R977.3； R977.6

A

1672-4194(2016)06-0354-06