改良QuEChERS /LC-MS /MS聯用檢測水稻及其土壤中呋蟲胺的方法

韓昕煒， 康 頔， 張海珍， 盧 平， 胡德禹

(貴州大學 精細化工研究開發中心， 綠色農藥與農業生物工程國家重點實驗室培育基地和教育部綠色農藥與生物工程重點實驗室， 貴州 貴陽 550025)

改良QuEChERS /LC-MS /MS聯用檢測水稻及其土壤中呋蟲胺的方法

韓昕煒， 康 頔， 張海珍， 盧 平， 胡德禹*

(貴州大學 精細化工研究開發中心， 綠色農藥與農業生物工程國家重點實驗室培育基地和教育部綠色農藥與生物工程重點實驗室， 貴州 貴陽 550025)

為了尋求水稻中快速定量檢測呋蟲胺的方法，稻田土壤、糙米、稻殼及植株樣品采用改良的QuEChERS法處理，稻殼和植株樣品采用PSA和C18吸附劑凈化，LC-MS/MS檢測，外標法定量，建立改良QuEChERS/LC-MS/MS聯用分析檢測水稻田中的呋蟲胺。結果表明：在0.015～0.4 mg/kg添加水平范圍內，稻田土壤、糙米、稻殼以及植株中的平均回收率分別為92.32%～97.45%，93.90%～101.0%，84.30%～99.20%和77.50%～79.00%；相對標準偏差(RSD,n=5)分別為3.52%～4.32%，1.20%～2.60%，0.60%～3.30%和1.20%～2.00%。此方法的最低檢測限(LOD)為1.75×10-12g，最低定量限(LOQ)為5.84×10-12g。該方法前處理簡便，快速，靈敏度高，重現性好，符合農藥檢測分析的技術要求。

呋蟲胺； LC-MS/MS； 水稻； 殘留量

呋蟲胺(dinotefuran)是日本三井化學公司研發的第三代新煙堿類殺蟲劑[1-2]。呋蟲胺的化學名稱為1-甲基-2-硝基-3-(四氫-3-呋喃甲基)胍。呋蟲胺殺蟲譜廣，具有很強的內吸滲透作用，可防治各種半翅目、鱗翅目、甲蟲目、膜翅目等各種害蟲[3]。主要作用于昆蟲的神經傳遞系統，引起昆蟲麻痹從而起到殺蟲作用[4]。

關于呋蟲胺的分析檢測方法主要有高效液相色譜法、高效液相-串聯質譜法和超高液相-串聯質譜法。高效液相色譜法主要集中在大米、蔬菜、水果和?？苿游锛∪馀c肝臟上[5-11]；高效液相-串聯質譜法主要集中在玉米、茶葉和棉花上[12-14]；超高液相-串聯質譜法主要集中在蔬菜水果上[15-16]。已報道前處理過程多采用乙腈作為提取劑，凈化方法主要是SPE固相萃取[5-16]，耗時且過程復雜，但采用近年來國際上最新發展起來的用于農產品檢測的快速樣品前處理技術(QuEChERS)結合液相-串聯質譜法在水稻上檢測的相關研究尚未見報道。故筆者采用改良的QuEChERS法提取，PSA和C18分散固相萃取凈化，旨在建立一種便捷的水稻及其環境中呋蟲胺檢測分析方法，為水稻田中呋蟲胺及其他新煙堿類殺蟲劑的快速定量檢測提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

1.1.1 儀器 液相色譜儀(LC-20ADXR型)購自日本島津公司，三重四級桿質譜儀(4000 QTRAP型)購自America A.B. Company；色譜柱，ZORBAX SB-C18 (4.6 mm×150 mm，5 μm)；渦旋混合器(QL-901)購自江蘇海門市麒麟醫用儀器廠，高速離心機(TGL-20B)購自上海安亭科學儀器廠，旋轉蒸發器(RE-52AA)購自上海亞榮生化儀器廠，循環式真空泵[SHZ-D(Ⅲ)]購自上海亞榮生化儀器廠。

1.1.2 試劑 呋蟲胺標準品(純度98%，Dr. Ehrenstorfer GmbH)、甲醇(HPLC)、乙腈(AR)、蒸餾水、N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18)、石墨化碳黑(GCB)和0.22 μm有機濾膜。

1.2 儀器條件的選擇

1.2.1 色譜條件 色譜柱為SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm )；流動相A，水(0.1%甲酸)；流動相B，甲醇(0.2%甲酸)；梯度洗脫條件為0～1 min，80%A；1～3 min，80%～10%A；3～5 min，10%A；5～10 min，10%～80%A；流速，0.5 mL/min；柱溫40℃；進樣體積5 μL。

1.2.2 質譜分析條件 電噴霧離子源：正離子掃描模式(ESI+)；離子源氣體(GS1)：60 psi；離子源氣體(GS2)，60 psi；離子噴霧電壓：5500 V；氣簾氣：30 psi；離子源溫度：650°C；采用多重反應監測(MRM)方式

1.3 標準溶液的配制

準確稱取0.020 4 g呋蟲胺至100 mL容量瓶，用甲醇配制成200 μg/mL呋蟲胺母液，4℃避光保存備用。將200 μg/mL呋蟲胺母液用甲醇稀釋成0.005 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、0.5 μg/mL和1 μg/mL系列標準溶液，繪制標準工作曲線，其中y為呋蟲胺峰面積，x為標準溶液濃度。

1.4 樣品的提取

1.4.1 土壤、糙米 稱取10.0 g樣品，于50 mL離心管中，加入1.5 g NaCl，加入乙腈提取(土壤30 mL，糙米15 mL)，渦旋1 min，離心3 min(6 000 r/min)，取1 mL上清液，過0.22 μm濾膜，LC-MS/MS檢測。

1.4.2 稻殼、植株 稱取5.0 g樣品于50 mL離心管中，加入1.5 g NaCl，加入20 mL乙腈，渦旋1 min，離心3 min(6 000 r/min)，取1 mL上清液，待凈化。

1.5 樣品的凈化

將1.3節1 mL上清液轉移至微型離心管中，加入0.05 g PSA和0.05 g C18，渦旋振蕩1 min，與6 000 r/min離心1 min，取上清液，過0.22 μm濾膜，LC-MS/MS檢測。

1.6 樣品的回收率與精密度測定

空白稻田土壤、糙米、稻殼及植株樣品分別作3個不同水平的添加回收率試驗。按上述分析方法提取、凈化和測定。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的確定

呋蟲胺的親水性較強，且在堿性環境中不穩定，故流動相應選擇中性或偏酸性環境，因此選擇正離子掃描模式。在電噴霧電離模式下對0.5 mg/kg呋蟲胺標準溶液以50～250一級質譜掃描，確定呋蟲胺母離子質荷比為203.1和響應信號最高時的錐孔電壓(DP)，然后優化DP，最終確定為51.31 V。以50～220二級質譜掃描，找到呋蟲胺2個特征子離子，質荷比分別為113.9和129.0，以豐度較強的子離子129.0定量；優化碰撞電壓(CE)，最終分別確定為16.49 eV和18.01 eV。

2.2 色譜條件的確定

2.2.1 流動相 在中性流動相條件下，在單一梯度流動相(甲醇∶水)色譜條件下，出峰時間較早且峰形較差，故采用梯度洗脫程序。在采用梯度流動相條件下，流動相為甲醇(0.2%甲酸)∶水(0.1%甲酸)。呋蟲胺標準溶液的峰形良好，保留時間為5.55 min(圖1)。

注：a為含甲酸梯度流動相色譜，b為不含酸梯度流動相色譜，c為單一流動相色譜。

Note: a, Chromatography of the mobile phase with formic acid gradient; b, Chromatography of the mobile phase without acid gradient; c, Chromatography of single mobile phase.

圖1 不同條件流動相的色譜圖

Fig.1 Chromatogram of mobile phase under different conditions

2.2.2 色譜柱 在確定流動相選用酸性條件的情況下，考察C18色譜柱。SB C18色譜柱適用于在pH較低的環境下分離藥物且在高含水量流動相中重現性好。鑒于SB C18色譜柱的特點和良好的性能，故選用色譜柱SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)。

2.3 凈化劑的選擇

水稻植株的凈化選用不同質量(30 mg和15 mg)GCB 凈化時，對呋蟲胺均有吸附作用，添加回收率均小于70%，不能滿足分析的要求(NY/T 788-2004)；選用C18或PSA時，添加回收率均>120%，也不能滿足分析的要求；選擇50 mg PSA+50 mg C18組合凈化時，凈化效果較好，且回收率為77.5～99.2%，能滿足分析的要求(圖2)。

圖2 不同吸附劑的回收率

2.4 標準曲線的繪制

在1.2液相色譜/質譜條件下進行測定，呋蟲胺的峰面積與其質量濃度間呈線性關系，標準曲線性方程為y=5.17×106x+5.46×105，R2=0.991 3，該方法的最小檢出限(LOD)為1.75×10-12g，最小定量限(LOQ)為5.84×10-12g。

2.5 樣品的回收率與精密度

由表可見：在0.015～0.4 mg/kg添加水平范圍內，稻田土壤、糙米、稻殼以及植株中的平均回收率為77.50%～101.0%，相對標準偏差(RSD，n=5) 為0.60%～4.32%。呋蟲胺在稻田土壤、糙米、稻殼以及植株上的驗證添加回收包括空白對照、基質加標準溶液和添加回收試驗，添加回收色譜較好(圖3)。

表 呋蟲胺水稻田基質(n=5)中的平均添加回收率

Table Average added recovery of Dinotefuran in paddy soil brown rice, rice hull and rice plant

樣品Sample添加水平/(mg/kg)Addedlevel平均回收率/%Averageaddedrecovery相對標準偏差/%RSD土壤Paddysoil0．01597．453．520．10096．083．960．30092．324．32糙米Brownrice0．015101．002．600．15096．301．200．30093．902．30稻殼Ricehull0．02099．201．780．20084．300．600．40085．803．30植株Riceplant0．02078．601．200．20077．501．800．40079．002．00

注：A為土壤，B為糙米，C為稻殼，D為植株；a為空白對照，b為基質加標準溶液，c為添加回收液。

Note: A, Paddy soil; B, Brown rice; C, Rice hull; D, Rice plant; a, CK; b, Substrate + standard solution; c, Addition recovery.

圖3 水稻田4種基質的添加回收色譜

Fig.3 Addition recovery chromatography of paddy soil, brown rice, rice hull and rice plant

3 小結

目前，針對呋蟲胺的分析殘留方法研究報道僅見采用高效液相色譜法和超高效液相色譜-串聯質譜法[11,14,17]，前處理過程中提取方法復雜，凈化方法耗時，且操作較為繁瑣。本試驗通過對水稻田中土壤、糙米、稻殼和植株4種基質的前處理條件、流動相條件、質譜條件等的優化，建立改良的QuEChERS法結合液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)檢測水稻田4種基質的呋蟲胺殘留量的分析方法。該方法前處理操作簡單、省時，高效液相-串聯質譜法檢測，選擇性和靈敏度高，為水稻田中呋蟲胺和其他新煙堿類殺蟲劑的快速定量檢測提供依據。

[1] 劉安昌,張 良,譚珍友, 等. 新型煙堿類殺蟲劑呋蟲胺的合成研究[J]. 世界農藥, 2009, 31(2): 22-23.

[2] 趙 聰,楊文革,胡永紅,等.呋蟲胺及其中間體的合成方法[J].現代農藥,2009,8(2):13-19.

[3] 張亦冰.新內吸殺蟲劑-呋蟲胺[J].世界農藥,2003,25(5):46-47.

[4] 吳鴻飛,孫 克,張敏恒.呋蟲胺合成方法評述[J].農藥,2013,52(1):71-74.

[5] 乙小娟,朱加葉,丁 萍,等.高效液相色譜法快速測定大米中的4種煙堿農藥殘留量[J].食品科學,2011,132(6):169-172.

[6] Zhiming Xiao,Xiaowei Li,Xiaolin Wang, et al.Determination of neonicotinoid insecticides residues in bovine tissues by pressurized solvent extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B.2011,879(1):117-122.

[7] 侯如燕,卞紅正,趙秀霞,等.固相萃取-液相色譜測定復雜基質蔬菜中9種煙堿類殘留[J].分析測試學報,2011,30(1):58-63.

[8] Lina Hem, Abd El-Aty A M, Jong-Hyouk Park, et al. Determination of Dinotefuran in Pepper UsingLiquid Chromatography: Contribution to Safety Evaluation[J]. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 2012, 55(6): 756-768.

[9] Rahman M M,Park J H,Abd E A,et al.Feasibility and application of an HPLC/UVD to determine dinotefuran and its shorter wavelength metabolites residues in melon with tandem mass confirmation[J].Food chemistry,2013,136(2):1038-1046.

[10] 張小東,龔道新,吳 亮,等.高效液相色譜法測定稻田樣品中3中新煙堿類殺蟲劑殘留[J].農藥學學報,2015,17(5):627-632.

[11] 韋 婕,鄧 婕,黃慧俐,等.高效液相色譜檢測呋蟲胺在稻田水和土壤中的殘留及消解動態[J].農藥學學報,2015,17(2):195-200.

[12] 李 立,付 建,初玉圣,等.食品中呋蟲胺殘留量的HPLC-MS/MS檢測方法研究[J].食品科學,2008,29(11):538-540.

[13] Rahman M M,Abd El-Aty A M,Choi J H,et al.Consequences of the matrix effect on recovery of dinotefuran and its metabolites in green tea during tandem mass spectrometry analysis[J].Food Chemistry,2015,168:445-453.

[14] 張雯雯,徐 軍,張 盈,等.超高液相色譜-串聯質譜法檢測棉花和土壤中呋蟲胺殘留[J].植物保護,2015,41(2):125-129.

[15] Ying Zhang,Jun Xu,Fengshou Dong, et al.Simultaneous determination of four neonicotinoid insecticides residues in cereals, vegetables and fruits using ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Analytical Methods,2013,5(6):1449-1455.

[16] Shaoying Liu,Zuntao Zheng,Fanglin Wei,et al.Simultaneous determination of seven neonicotinoid pesticide residues in food by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Journal of agricultural and food chemistry,2010,58(6):3271-3278.

[17] 彭 莎,楊仁斌,鄒 蓉,等.高效液相色譜測定水稻和稻田中呋蟲胺殘留分析法的建立[J].湖南農業科學,2013(7):79-81.

(責任編輯： 劉忠麗)

Dinotefuran Residue in Paddy Soil, Brown Rice, Rice Hull and Rice Plant Determined by Modified QuEChERS/LC-MS/MS

HAN Xinwei, KANG Di, ZHANG Haizhen, LU Ping, HU Deyu*

(TheCultivationBasisofNationalKeyLaboratoryforGreenPesticideandAgriculturalBioengineering/KeyLaboratoryofGreenPesticideandAgriculturalBioengineering,MinistryofEducation,CenterforResearchandDevelopmentofFineChemicals,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

The paddy soil, brown rice, rice hull and rice plant samples were first pre-treated with modified QuEChERS, then the rice hull and plant samples were purified by PSA and C18adsorbent and finally the Dinotefuran residue in four samples was detected by LC-MS/MS to discuss the rapid quantitative method of detecting Dinotefuran residue in paddy soil, brown rice, rice hull and rice plant. Results:The average recovery of paddy soil, brown rice, rice hull and rice plant samples is 92.32%～97.45%, 93.90%～101.0%, 84.30%～99.20% and 77.50%～79.00% within the addition range of 0.015～0.4 mg/kg Dinotefuran separately and RSD of paddy soil, brown rice, rice hull and rice plant samples is 3.52%～4.32%, 1.20%～2.60%, 0.60%～3.30% and 1.20%～2.00% respectively. The limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) of the modified QuEChERS/LC-MS/MS is 1.75×10-12g and 5.84×10-12g respectively. The modified QuEChERS/LC-MS/MS with the advantages of simple pretreatment, rapidity, high sensitivity and good repeatability accords with the technical requirement of pesticide detection analysis.

Dinotefuran; LC-MS/MS; rice; residue

2015-02-24； 2016-04-20修回

貴州省重大科技專項“貴州省茶葉、蔬菜質量安全評價、檢測和可追溯關鍵技術研究與應用” [黔科合重大專項字(2013)6024]；貴州大學創新基金項目“20%呋蟲胺泡騰片在水稻上的殘留分析及消解動態研究”(2015048)

韓昕煒(1990-)，女，在讀碩士，研究方向：農藥學。E-mail:18286155960@163.com

*通訊作者：胡德禹(1965-)，女，研究員，從事農藥分析研究。E-mail:gzu_dyhu@126.com

1001-3601(2016)05-0199-0047-04

S482.3+9

A