急性腦梗死患者miR-210的表達及意義

吳　皎　姜　新　陳曉紅

遼寧省人民醫院神經內科　沈陽　110016

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急性腦梗死患者miR-210的表達及意義

吳皎姜新陳曉紅

遼寧省人民醫院神經內科沈陽110016

【摘要】目的探討急性腦梗死(ACI)患者血清中缺氧激活因子微小RNA-210(miR-210)的表達情況及臨床意義。方法選取2013-01—2015-01在我院治療的ACI患者122例(ACI組)，同時選擇同期健康體檢人群80例為對照組，采用反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測血清miR-210表達水平。結果ACI組miR-210表達量為(1.24±0.07)2-△△Ct，明顯低于對照組的(2.02±0.11)2-△△Ct，差異有統計學意義(P<0.05)；男女ACI患者血清miR-210表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；≤60歲和>60歲ACI患者血清miR-210表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；重度ACI患者血清miR-210表達為(1.10±0.08)2-△△Ct，明顯低于輕度和中度患者，差異有統計學意義(P<0.05)；中度ACI患者血清miR-210表達為(1.29±0.10)2-△△Ct，低于輕度患者，差異有統計學意義(P<0.05)；miR-210對ACI的ROC曲線下面積為0.961，95% CI為0.926～0.996，截斷值為(1.378)2-△△Ct，時，靈敏度為91.30%，特異度為97.54%。結論急性腦梗死患者血清中miR-210表達減弱，且與急性腦梗死嚴重程度有關，可作為急性腦梗死的診斷依據。

【關鍵詞】急性腦梗死；miR-210；診斷價值；疾病程度

隨著社會的不斷發展，人們生活方式及飲食習慣均發生較大改變，且社會老齡化趨勢明顯，故高血壓、高血脂以及糖尿病患者日益增多，加之當前快節奏生活使其漸漸忽視自己身體健康，運動量下降甚至不運動，同時部分人嗜煙好酒及喜“三高”食品，故造成急性腦梗死(acute cerebral infarction，ACI)的發病率不斷提高。ACI發病突然性高，病情發展速度快，具有較高病死率，即使患者被搶救成功，均會造成癱瘓、腦神經損傷、語言及肢體功能障礙等后遺癥，致殘率極高[1]。有報道稱[2-3]，血清中缺氧激活因子微小RNA-210(miR-210)的表達水平和急性腦梗死的形成以及發展具有相關性，本文探討其具體關系，報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取2013-01—2015-01在我院治療的急性腦梗死(ACI)患者，納入標準：(1)診斷符合《中國急性缺血性卒中診治指南2010》中的標準[4]；(2)均經頭顱CT或MRI證實；(3)均為發病48 h內住院治療；(4)患者及家屬知情同意，并簽署同意書。排除標準：合并其他腫瘤、免疫系統疾病者。本次研究共納入患者122例(ACI組)，根據美國國立衛生研究院腦卒中量表(NIHSS)評分標準，<5分為輕度，5～20分為中度，>20分為重度，其中輕度36例，中度55例，重度31例。同時選擇同期健康體檢人群80例為對照組，2組性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　2組一般資料比較

1.2血樣采集患者于腦梗死3 d后分別抽取空腹靜脈血3～4 mL滴入抗凝試管，靜置30～35 min，用3 200 r/min離心5 min，取上清液滴入干凈試管，于-80 ℃條件下冷藏備用。

1.3RNA提取方法將分離上清溶液滴加1 mL Trizol試劑進行充分裂解[5]，于5 min后加200 μL氯仿，于4 ℃下取12 000 r/min進行離心15 min，后加入500 μL異丙醇，室溫放置20 min，4 ℃下11 000 r/min離心20 min，將上清棄，加75%的乙醇1 mL后用漩渦器進行震蕩以混均，再次于4 ℃下12 000 r/min進行離心15 min后保存備用。

1.4反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測miRNA反轉錄總反應體系為30 μL，包括[6]RNA=1 μL×250 ng/1 μL、4種核糖三磷酸溶液=2 μL、無 RNA 酶雙蒸水=20 μL、反應引物=2 μL、上樣緩沖液(10×)=3 μL、RNA反應抑制酶=0.5 μL、RNA反轉錄酶1.5 μL。15 ℃下反應30 min、45 ℃下反應30 min、85 ℃下反應5 min，于4 ℃保存。

熒光定量 PCR總反應體積22 μL，包括cDNA 稀釋液= 3 μL、SYBR熒光混合液(2×)=12 μL、上游引物=1 μL、下游引物=1 μL、ddH2O= 5 μL。95 ℃反應 30 s、60 ℃反應30 s，循環35次后72 ℃下反應5 min，于4 ℃保存。通過儀器測定PCR熒光強度，使用2-ΔΔCt法計算miR-210基因相對表達。

2結果

2.12組血清miR-210表達情況ACI組miR-210表達量明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

組別n血清miR210表達(2-△△Ct)t值P值ACI組1221.24±0.07對照組802.02±0.11-61.611<0.05

2.2血清miR-210表達與患者年齡、性別關系男女ACI患者血清miR-210表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；≤60歲和>60歲ACI患者血清miR-210表達差異比較無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3　不同年齡、性別患者血清miR-210

2.3不同程度梗死患者血清miR-210表達情況重度ACI患者血清miR-210表達明顯低于輕度和中度患者，差異有統計學意義(P<0.05)；中度ACI患者血清miR-210表達低于輕度患者，差異有統計學意義(P<0.05)。隨梗死程度的加重，患者miR-210表達呈降低趨勢。見表4。

表4　不同程度梗死患者血清miR-210

2.4血清miR-210對ACI的診斷價值采用ROC曲線分析miR-210對ACI的診斷價值，結果顯示ROC曲線下面積為0.961，95%CI為0.926～0.996，截斷值為(1.378)2-△△Ct，靈敏度為91.30%，特異度為97.54%。見圖1。

圖1　血清miR-210診斷ACI的ROC曲線

3討論

現代醫學已證實，ACI發病機制為人大腦血管閉塞所致腦組織供血及供氧不足，從而導致一系列的炎癥、腦細胞凋亡及腦組織損傷和腦血管再生障礙等病理性異變[7]。ACI患者多伴神經功能障礙，殘疾率較高。既往研究顯示[8]，人細胞內miRNA表達水平和供血及供氧具有密切相關性，尤其低血氧可明顯導致miRNA變化。文獻報道，絕大多數miRNA能明顯影響人體血及氧供應，并可調節組織再灌注損傷過程中細胞凋亡過程。有研究認為，當人大腦處于較嚴重缺血狀態時，miRNA表達將會呈現上升，這可能和其具有促進新血管生成機制相關。也有動物實驗證明[9]，鼠全腦處于缺血及再灌注損傷時，其海馬miR-210和miR-21會呈現明顯變化。本研究中，ACI組患者miR-210表達量明顯低于對照組(P<0.05)，證明人腦出現損傷時，其血液中miR-210也會出現變化，且和腦損傷具有負相關性。這可能是因miR-210可被低氧誘導因子誘導，當ACI患者大腦血管阻塞時，腦組織處于低氧狀態，miR-210表達量需呈現下降方可在低氧狀態下暴露，已被低氧誘導因子辨識后誘導轉錄。研究顯示，miR-210在低氧狀態下細胞調控過程中具有重要意義，其在腦組織及腦血管血液中均有表達。

目前研究還顯示，miRNA可通過調控細胞凋亡因子及增殖因子表達水平，能夠影響細胞生長周期，促進新生細胞生成，尤其可致血管內皮細胞在短時間快速增殖以修復腦血管損傷，且miRNA和炎癥反應間具有相互促進作用，啟動炎癥“瀑布”信號表征。研究顯示[10]，miR-210在正常人血液內表達水平穩定，其異常表達變化對人體疾病及損傷反應具有較強敏感性。同時，miR-210檢測方法較簡便，僅需抽取患者靜脈血做常規RNA提取便可，故其已被廣泛應用于多種癌癥及危重型疾病診斷中。本研究中，重度ACI患者血清miR-210表達明顯低于輕度和中度患者(P<0.05)，中度ACI患者血清miR-210表達低于輕度患者(P<0.05)。說明隨梗死程度的加重，患者miR-210表達呈降低趨勢，也證明腦梗死作為一種重度炎癥反應，其病情的嚴重程度可被miR-210明顯表達。本研究中，miR-210對ACI診斷的ROC曲線下面積為0.961，靈敏度91.30%，特異度97.54%，證明miR-210表達水平對于ACI診斷及治療預后具有較為重要的指導意義。

值得注意的是，本研究中男女ACI患者血清miR-210表達比較差異無統計學意義；60歲以上和以下ACI患者血清miR-210表達比較差異也無統計學意義，這表明miR-210表達水平與患者的年齡和性別無相關性，證明其作為一種常規標識檢測指標以診斷及判斷ACI治療結果的可行性。

4參考文獻

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(收稿2014-12-18)

The expression of miR-210 in patients with ACI and its significance

WuJiao，JiangXin，ChenXiaohong

DepartmentofNeurology，thePeople’sHospitalofLiaoningProvince，Shenyang110016，China

【Abstract】Objective To investigate the expression of micro RNA-210 (miR-210) in acute cerebral infarction (ACI) patients serum and its clinical significance. Methods From Jan. 2013 to Jan. 2015，122 patients with ACI treated in our hospital (ACI group) were selected，at the same time，80 healthy people were selected as the control group，the serum miR-210 expression level was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Results The ACI group mir-210 expression amount(1.24±0.07)2-△△Ct，was significantly lower than that in control group (2.02±0.11)2-△△Ct，the difference was statistically significant (P<0.05)； Male and female ACI patients serum mir-210 expression differences were no statistically significant (P>0.05)； ≤60 years old and >60 years old ACI patients serum mir-210 expression differences were no statistically significant (P>0.05)； Severe ACI patients serum mir-210 expression (1.10±0.08) 2-△△Ct，was significantly lower than that in the mild and moderate patients，the difference was statistically significant (P<0.05). Moderate ACI patients serum mir-210 expression (1.29±0.10) 2-△△Ct，which was lower than the mild patients，the difference was statistically significant (P<0.05)； mir-210 on ACI the area under ROC curve was 0.961，95%CIwas 0.926～0.996，cut-off value was (1.378) 2-△△Ct，sensitivity was 91.30%，specificity was 97.54%. Conclusion The serum miR-210 expression in acute cerebral infarction patients decreases and is related to the severity of acute cerebral infarction，which can be used as the basis for the diagnosis of acute cerebral infarction.

【Key words】Acute cerebral infarction； miR-210； Diagnostic value； Disease level

【中圖分類號】R743.33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)03-0003-03