胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MYH-9與胃癌轉(zhuǎn)移及其預(yù)后的關(guān)系

朱　捷　丁　皓　王校紅

作者單位：200041 上海市復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院

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胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MYH-9與胃癌轉(zhuǎn)移及其預(yù)后的關(guān)系

朱捷丁皓王校紅

作者單位：200041 上海市復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院

【摘要】目的研究胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MYH-9與胃癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。方法50例組織標(biāo)本取自手術(shù)切除的胃癌組織及同一患者的腹膜轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本。組織固定在10%的緩沖甲醛溶液用于病理診斷，冷凍于液氮中備于免疫印跡分析、細(xì)胞培養(yǎng)、siRNA轉(zhuǎn)染、細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)。結(jié)果MYH-9在所有的鱗狀細(xì)胞癌組織(100%)和8個(gè)鄰近正常組織中表達(dá)(26.7%，P=0.000)。癌組織中MYH-9高表達(dá)水平與腹膜轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度差和較晚的腫瘤分期顯著相關(guān)。單變量分析結(jié)果顯示:腫瘤分期、胃癌病灶是否切除、腹膜轉(zhuǎn)移的存在、MYH9高表達(dá)(基于免疫組化染色)與患者總生存率顯著相關(guān)(P=0.008、P=0.001、P=0.006和P=0.007)。進(jìn)一步的多因素回歸分析顯示，腫瘤分期與MYH-9高表達(dá)是與總生存期相關(guān)的獨(dú)立不良預(yù)后因素。結(jié)論MYH-9的過度表達(dá)可能與較高的癌細(xì)胞遷移性相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】胃癌；腹膜轉(zhuǎn)移；MYH-9；預(yù)后

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:195～197)

目前有關(guān)MYH-9基因在胃癌中的表達(dá)、作用及其機(jī)制的報(bào)道很少。因此本文重點(diǎn)研究胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MYH-2在胃癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后中的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1　一般資料

組織標(biāo)本取自2011年4月至2014年9月于本院手術(shù)切除或探查的胃腺癌組織及同一患者的腹膜轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本，共50例。男性33例、女性17例，其中行胃癌病灶切除者41例、未切除者9例。所有患者在手術(shù)前均未接受放療或圍術(shù)期化療。臨床病理分期是根據(jù)國際聯(lián)盟描述防癌病理腫瘤節(jié)點(diǎn)轉(zhuǎn)移(PTNM)的標(biāo)準(zhǔn)確定分類(2009)，2例為ⅠB期，15例為ⅡA期，5例為ⅡB期，14例為ⅢA期，8例為ⅢB期，6例為Ⅳ期。組織固定在10%的緩沖甲醛溶液用于病理診斷，冷凍于液氮中備于免疫印跡分析。隨訪所有患者，總體生存時(shí)間記錄為手術(shù)至死亡或最后一次隨訪時(shí)間。本研究獲得患者知情同意書及醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2　免疫組化法

厚4 μm的組織切片由福爾馬林液固定，石蠟包埋手術(shù)標(biāo)本并置于載玻片上。脫蠟和水合后，用封閉緩沖液(3%H2O2)破壞內(nèi)源性過氧化物酶，并在壓力消毒器中進(jìn)行抗原修復(fù)。2%正常山羊血清浸潤玻片，室溫下10 min后，加入抗肌球蛋白ⅡA的小鼠單克隆抗體(1∶500稀釋)，并在37 ℃下維持1 h。第二和第三廣譜抗體隨后加入。載玻片與3-氨基-9- 乙基咔唑(AEC)底物溶液(AEC-0037，邁新生物，福州，中國)在37 ℃的水浴中20 min。洗滌后，將載玻片用蘇木精染色。陰性對(duì)照用磷酸緩沖鹽水(PBS)處理，而不是肌球蛋白ⅡA抗體。

1.3　siRNA轉(zhuǎn)染

MYH9的SiRNA(HS-MYH9-1，目錄號(hào)SI00038346，和HS-MYH9-6，目錄號(hào)SI02654911)，陽性對(duì)照siRNA(HS-MAPK1/3，目錄號(hào)SI03650367)，和陰性對(duì)照siRNA(按Ctrl - AllStars中-1，目錄號(hào)SI03650318)購自Qiagen公司(瓦倫西亞，CA，美國)。細(xì)胞的siRNA的轉(zhuǎn)染根據(jù)HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen公司)的指導(dǎo)進(jìn)行。簡言之，將陽性對(duì)照siRNA(MAPK1/3)轉(zhuǎn)染入KYSE-510細(xì)胞，以優(yōu)化HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑與siRNA的比率，并獲得最佳的沉默效應(yīng)。轉(zhuǎn)染2個(gè)MYH9 siRNA，找到有效的siRNA。

1.4　免疫印跡分析

完全除去生長培養(yǎng)基收集細(xì)胞，并加入細(xì)胞裂解緩沖液(含有蛋白酶抑制劑混合物1∶100)進(jìn)行裂解。細(xì)胞裂解物用橡皮刮收集。腫瘤和鄰近的正常組織冷凍在液氮中，并用粉末狀的研缽和杵和通過細(xì)胞裂解緩沖液裂解。樣品轉(zhuǎn)移至微量離心管，均質(zhì)化，4℃下以14 000 r/min，15 min微量離心沉淀蛋白。將樣品溶于十二烷基硫酸鈉(SDS)的緩沖液然后煮沸。SDS樣品通過聚丙烯酰胺凝膠電泳解析，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。拍攝免疫印跡蛋白。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)數(shù)資料采用t檢驗(yàn)，而分類變量采用χ2檢驗(yàn)。Kaplan-Meier法評(píng)估生存曲線，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)曲線之間的差異。Cox回歸分析評(píng)估臨床病理因素和肌球蛋白ⅡA表達(dá)的預(yù)后價(jià)值。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　MYH9表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期的相關(guān)性

MYH9表達(dá)于所有癌組織細(xì)胞質(zhì)和部分癌癥組織的細(xì)胞膜上。一些正常胃上皮細(xì)胞也呈低水平表達(dá)。在癌組織中MYH9陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織(100.0%和26.7%，χ2=50.575，P=0.000)。除了免疫組織化學(xué)分析，28個(gè)腫瘤樣品和它們的配對(duì)正常鄰近組織，通過免疫印跡分析定量測定MYH9的表達(dá)水平。免疫組化檢測結(jié)果一樣，免疫印跡分析檢測到28個(gè)腫瘤中均有MYH9的表達(dá)。免疫組化檢測腫瘤患者50例，其中25例(50%)有較強(qiáng)的MYH9免疫反應(yīng)。患者臨床病理特征與鱗狀細(xì)胞癌和MYH9表達(dá)之間的相關(guān)性見表1。分析表明，MYH9表達(dá)水平與腫瘤腹膜轉(zhuǎn)移(P=0.015<0.05)，腫瘤分化較差(P=0.018<0.05)，以及腫瘤分期較晚(ⅢB期和Ⅳ期，P=0.007<0.01)相關(guān)。

表1　MYH9表達(dá)與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性(例，%)

2.2　MYH9表達(dá)與患者生存率的關(guān)系

單因素和多因素分析50例患者的整體生存信息。平均隨訪時(shí)間為19.5個(gè)月(4～34個(gè)月)。單變量分析結(jié)果顯示：腫瘤分期、胃癌病灶是否切除、腹膜轉(zhuǎn)移的存在、MYH9高表達(dá)(基于免疫組化染色)與患者總生存率顯著相關(guān)(P=0.008、P=0.001、P=0.006和P=0.007)，見表2。

表2　單因素Cox回歸分析總生存期

對(duì)MYH9高表達(dá)、腹膜轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、胃癌病灶是否切除進(jìn)行多變量分析，Cox多因素回歸分析結(jié)果顯示：腫瘤分期和MYH9高表達(dá)是總生存期(P=0.012和P=0.018)顯著相關(guān)的獨(dú)立不良預(yù)后因素,見表3。

表3　多因素Cox回歸分析總生存期

3討論

在這項(xiàng)研究中，觀察到胃腺癌癌鱗狀細(xì)胞癌組織中，MYH9的表達(dá)增高。MYH9的高表達(dá)與腹膜轉(zhuǎn)移，較差的癌癥分化，晚期腫瘤階段及不良預(yù)后相關(guān)。在鱗癌細(xì)胞中，肌球蛋白ⅡA由MYH9的siRNA編碼，其能夠增加細(xì)胞基質(zhì)粘附和細(xì)胞遷移[1]。這些結(jié)果表明，MYH9的高表達(dá)可能是胃癌鱗狀細(xì)胞癌臨床預(yù)后差的預(yù)測指標(biāo)。細(xì)胞遷移涉及細(xì)胞突，極化，附著到細(xì)胞外基質(zhì)，粘附以及細(xì)胞尾縮回。肌球蛋白ⅡA據(jù)參與這一系列的步驟。MYH9基因編碼的肌球蛋白ⅡA族分子組裝成肌球蛋白纖絲整個(gè)細(xì)胞，并最終形成的蜂窩結(jié)構(gòu)，諸如應(yīng)力纖維與肌動(dòng)蛋白絲連接[2]。肌球蛋白ⅡA依賴性收縮力細(xì)胞體向前運(yùn)動(dòng)，同時(shí)解離附著在細(xì)胞后部尾巴(肌球蛋白ⅡA依賴性)，完成細(xì)胞收縮和向前運(yùn)動(dòng)。在此過程中，牽引力的約60%是由肌球蛋白ⅡA生成的[3]。肌球蛋白ⅡA在細(xì)胞突起粘著復(fù)合物的成熟過程中必不可少。在目前的研究中，肌球蛋白ⅡA siRNA介導(dǎo)抑制癌細(xì)胞的遷移；這一發(fā)現(xiàn)與已發(fā)表的研究一致。因?yàn)榧?xì)胞遷移的速度取決于與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，我們研究抑制肌球蛋白ⅡA族是否影響細(xì)胞-基質(zhì)粘附性[4]。結(jié)果表明，MYH9 siRNA-介導(dǎo)的肌球蛋白ⅡA顯著增加細(xì)胞粘附到基質(zhì)。這一發(fā)現(xiàn)與巴賓等的觀察人結(jié)腸上皮細(xì)胞結(jié)果是一致的[5]。本文研究胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MYH-2在胃癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后中的關(guān)系時(shí)，首先討論MYH9表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期相關(guān)性。MYH9表達(dá)于所有癌癥組織細(xì)胞質(zhì)和某些癌癥組織中的細(xì)胞膜上。一些正常食管上皮細(xì)胞也表現(xiàn)出低水平的表達(dá)。在癌組織中的陽性MYH9的表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織。除了免疫組織化學(xué)分析，28個(gè)腫瘤樣品和它們的配對(duì)正常鄰近組織，通過免疫印跡分析定量測定MYH9的表達(dá)水平。免疫組化檢測結(jié)果一樣，免疫印跡分析檢測到28個(gè)腫瘤中均有MYH9的表達(dá)[6]。免疫組化檢測的腫瘤50例，其中25例(50%)有較強(qiáng)的MYH9免疫反應(yīng)。患者臨床病理特征與鱗狀細(xì)胞癌和MYH9表達(dá)之間的相關(guān)性分析表明，MYH9表達(dá)水平與腹膜轉(zhuǎn)移、分化較差以及晚期腫瘤分期相關(guān)。此外，單因素和多因素分析50名患者的整體生存信息。平均隨訪時(shí)間為19.5個(gè)月(4～34個(gè)月)。單變量分析，腫瘤分期、胃癌病灶是否切除、腹膜轉(zhuǎn)移的存在、MYH9高表達(dá)與總生存期有顯著的關(guān)聯(lián)。腫瘤分期、胃癌病灶是否切除、腹膜轉(zhuǎn)移的存在、MYH9高表達(dá)均進(jìn)行多變量分析，以確定預(yù)后不良因素。Cox多因素回歸分析，腫瘤分期和MYH9高表達(dá)是總生存期顯著相關(guān)的獨(dú)立不良預(yù)后因素。本文免疫組化的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)球MYH9的表達(dá)水平在低分化組最高。這可以通過肌球蛋白ⅡA的細(xì)胞分裂來解釋[7]。然而，在本研究中，發(fā)現(xiàn)MYH9的表達(dá)與腫瘤浸潤深度之間沒有關(guān)系,這不同于巴賓等報(bào)道[8]。

總之，MYH9的高表達(dá)與胃癌鱗狀細(xì)胞癌、腹膜轉(zhuǎn)移，癌癥晚期階段，降低總體生存顯著相關(guān)。

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(編輯：吳小紅)

Relationship between Peritoneal Metastasis-Related Gene MYH-9 and Metastasis and Prognosis of Gastric Cancer

ZHUJie,DINGHao,WANGXiaohong.HuashanHospitalAffiliatedtoFudanUniversityofShanghai,Shanghai,200041

【Abstract】ObjectiveTo study the relationship between peritoneal metastasis-related gene MYH-9 and metastasis and prognosis of gastric cancer.Methods50 cases of tissue samples were obtained from gastric tissue after surgical resection and retroperitoneal metastasis tissue of the same patient.Tissues were fixed in 10% buffered formalin solution for pathological diagnosis,frozen in liquid nitrogen prepared in immunoblot analysis,cell culture,siRNA transfection,cell adhesion experiments.ResultsThe expression of MYH-9 (26.7%,P=0.000) in all of squamous cell carcinoma (100%) and 8 adjacent normal tissues.In the cancer tissues,MYH-9 expression levels increased significantly with lymph node metastasis,differentiation and malignant cancer,as well as associated with advanced tumor stage.Single factor analysis showed that tumor stage,lesion resection,peritoneal metastasis,and MYH-9 high expression (based on immunohistochemical staining) were significantly associated with overall survival (P=0.008,P=0.001,P=0.006 andP=0.007).Further multivariate regression analysis showed that tumor stage and MYH-9 high expression were associated with the overall survival of the independent adverse prognostic factors.ConclusionOverexpression of MYH-9 may related with cancer cell migration.

【Key words】Gastric cancer;Peritoneal metastasis;MYH-9;Prognosis

(收稿日期2015-03-24修回日期 2015-09-14)

中圖分類號(hào)：R735.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)02-0195-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.02.006