基因沉默白介素8對激素非依賴前列腺癌干細胞的生物特性的影響

孫夢奎　張紀恒　崔　韻　金　杰

作者單位:100034 北京大學第一醫(yī)院

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基因沉默白介素8對激素非依賴前列腺癌干細胞的生物特性的影響

孫夢奎張紀恒崔韻金杰

作者單位:100034 北京大學第一醫(yī)院

【摘要】目的探討小干擾RNA沉默激素非依賴前列腺癌DU145細胞白介素8基因對腫瘤干細胞生物學特性及耐藥性的影響。方法用不同劑量的小干擾RNA沉默激素非依賴前列腺癌DU145細胞IL-8基因，應用流式儀檢測ALDH陽性細胞比例的變化。采用懸浮細胞成球和克隆形成實驗分別觀察腫瘤干細胞自我更新和體外成瘤能力的變化。Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡雙染試劑盒檢測細胞凋亡率的變化，Western-blot法分析Akt蛋白的變化。結果DU145細胞IL-8基因的沉默能降低腫瘤干細胞的比例，顯著降低腫瘤干細胞懸浮細胞成球率和克隆形成率。多西他賽能顯著抑制IL-8基因沉默DU145細胞的活性。Western-blot顯示Akt的磷酸化被顯著抑制。結論IL-8基因的沉默能顯著抑制激素非依賴前列腺癌干細胞的自我更新和體外成瘤能力，增加該群細胞對多西他賽的化療敏感性，同時顯著抑制了Akt的磷酸化，這可能是IL-8基因沉默抑制該群細胞干細胞特性的作用機制之一。

【關鍵詞】IL-8；DU145；腫瘤干細胞；Akt

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:191～194)

有研究表明IL-8在激素非依賴前列腺癌中高表達，而在激素敏感前列腺癌和正常前列腺上皮中低表達[1]。有報道稱白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)能夠促進肝癌干細胞的生長，促進神經(jīng)膠質瘤干細胞的轉移，阻斷IL-8能夠很有效的殺傷乳腺癌干細胞[2-4]。本實驗將通過小干擾RNA沉默前列腺癌細胞IL-8基因，觀察腫瘤干細胞比例、干細胞特性、化療敏感性的變化以及出現(xiàn)該現(xiàn)象的潛在機制，為激素非依賴前列腺癌的臨床治療提供一定的參考。

1材料與方法

1.1　激素非依賴前列腺癌細胞系

激素非依賴前列腺癌細胞株DU145購于ATCC(American Type Culture Collection)公司。細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPIM-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)中，添加青霉素 100 IU/mL、鏈霉素 100 IU/mL。

1.2　試劑與儀器

IL-8 siRNA購于蘇州吉瑪公司，ALDEFLUORTM試劑盒購于STEMCELL公司，Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡雙染試劑盒購于南京凱基生物科技有限公司，CCK-8購于日本東仁公司，CD44、Oct4、IL-8、GAPDH抗體購于美國CST公司，極低黏附培養(yǎng)板購于美國康寧公司，流式儀(FAS Scan，Becton Dickinson，美國)，酶標儀(Thermo公司，美國)。

1.3　主要方法

1.3.1siRNA轉染IL-8 siRNA有效序列為：上游:5’-GCCAGAUGCAAUACAAGAUTT-3’下游:5’-AUCCUUGUAUUGCAUCUGGCTT-3’，陰性對照組(negative control，NC)，序列為：上游:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，下游:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。細胞接種于含10%胎牛血清的RPIM 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，使用INTERFERINGTM試劑轉染(Polyplus Transfection，法國)，按試劑盒操作說明優(yōu)化轉染條件，分別將IL-8 siRNA以20、40和80 nM的終濃度加入DU145細胞培養(yǎng)液，轉染48 h以后，細胞用于其它功能實驗。

1.3.2流式儀鑒定和分選前列腺癌腫瘤干細胞胰酶消化不同濃度轉染后的DU145細胞，2 000 rpm/min水平離心5 min，棄上清，用磷酸鹽緩沖液重懸，使細胞濃度達到106個/mL。按5 μL/mL的濃度加入Aldefluor的底物與離心管中，對二乙氨基苯甲醛(DEAB)為陰性對照組。混合均勻，37 ℃培養(yǎng)30 min，2 000 rpm/min，離心5 min，棄上清液，Aldefluor緩沖液重懸細胞，上機檢測與分選。

1.3.3懸浮細胞成球實驗操作方法如以前文章報道[5]，即分選后的DU145細胞，以5×103個/孔的細胞密度接種在極低黏附6孔板，每孔加入4 mL的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基、2% B27(Invitrogen)、20 ng/mL 表皮生長因子(EGF)、20 ng/mL 堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)(Peprotech)。10天以后，計數(shù)大于20個細胞的懸浮細胞球，懸浮細胞成球率(%)=(懸浮細胞球數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。

1.3.4克隆形成實驗分選后的DU145細胞，以500個/孔接種于普通6孔板，細胞培養(yǎng)在10%FBS的RPIM-1640培養(yǎng)基中。10天后，細胞用4%多聚甲醛固定，0.5%結晶紫染色。計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)，克隆形成率(%)=(形成克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。

1.3.5細胞活性檢測用40 nM siRNA和Scramble siRNA轉染DU145細胞，24 h后用流式儀分選出ALDH+細胞，各組分別以5×103個/孔的密度接種到96孔板中，并給予DMSO、1 nM、2 nM、4 nM、8 nM多西他賽處理72 h，然后每孔加入10 μL的CCK-8試劑和100 μL的新鮮培養(yǎng)基混合液。在37 ℃孵育1 h后，于波長450 nm處用酶標儀測定光密度(OD)值。細胞活性(%)=(siIL-8組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3.6Western Blot以RIPA裂解細胞獲得裂解液，等量蛋白采用12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后電轉到聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶常溫封閉2 h,加入一抗，4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，二抗常溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光和曝光顯影。其中一抗效價是1∶1 000~1∶2 000，選擇對照為GAPDH。

1.4　統(tǒng)計學方法

2結果

2.1　DU145細胞株中腫瘤干細胞的分選和鑒定

DU145細胞系中，運用流式細胞分選技術檢測ALDH+的細胞比例為(3.32±0.42)%(圖1)。

圖1　DU145細胞株前列腺癌干細胞的分選

2.2　IL-8 siRNA降低腫瘤干細胞的比例

IL-8 siRNA能顯著抑制IL-8基因的表達。20 nM、40 nM、80 nM siRNA處理DU145細胞后，前列腺癌干細胞的比例依次降低到(2.43±0.13)%、(1.56±0.12)%、(0.84±0.07)%(圖2)。

圖2　基因沉默IL-8對DU145細胞株腫瘤干細胞比例的影響

2.3　IL-8 siRNA增強前列腺癌干細胞對多西他賽的敏感性

相比陰性對照組，多西他賽能顯著抑制基因敲除組的細胞活性(圖3)。

圖3　基因沉默IL-8影響腫瘤干細胞對多西他賽

2.4　IL-8 siRNA抑制了Akt的磷酸化

分選的ALDH+細胞，用不同濃度的siRNA轉染48 h，發(fā)現(xiàn)IL-8 siRNA能抑制Akt蛋白的磷酸化，總Akt蛋白無明顯變化，見圖4。

圖4　基因沉默IL-8抑制腫瘤干細胞中Akt的磷酸化

2.5　IL-8 siRNA抑制前列腺癌干細胞的自我更新和體外成瘤能力

IL-8 siRNA能顯著抑制前列腺癌干細胞的干細胞特性，20 nM、40 nM和80 nM siRNA處理ALDH+的DU145細胞后，其懸浮細胞成球率依次降低為(8.67±0.34)%、(5.39±0.41)%和(4.22±0.22)%(圖5a),其細胞克隆形成率降低為(10.87±0.57)%、(6.17±1.04)%和(5.19±0.20)%(圖5b)。

圖5　基因沉默IL-8對前列腺癌干細胞懸浮成球和克隆形成能力的影響

3討論

激素非依賴期前列腺癌細胞能分泌IL-8，但是激素依賴期前列腺癌細胞和正常前列腺上皮細胞則不分泌。在前列腺癌中，乙醛脫氫酶(ALDH)的活性可以作為鑒定腫瘤干細胞的標志物。通過流式儀檢測，我們發(fā)現(xiàn)DU145細胞中包含有一群ALDH+的細胞。其能高表達干細胞標記物CD44和Oct4。在無血清低黏附培養(yǎng)環(huán)境下，腫瘤干細胞和正常干細胞具有極強的穩(wěn)定性，能形成懸浮細胞球，而非干細胞則不能存活。相比ALDH-細胞，ALDH+細胞具有很強的懸浮成球能力。本實驗結果與之前報道一致，驗證了ALDH+細胞具有很強的腫瘤干細胞特性，可以作為前列腺癌腫瘤干細胞的標志物[6]。同時我們發(fā)現(xiàn)IL-8蛋白在ALDH+細胞中的表達量明顯高于ALDH-群。

為了探究IL-8與激素非依賴前列腺癌干細胞的關系，本實驗用小干擾RNA沉默DU145細胞系，發(fā)現(xiàn)ALDH+細胞的比例明顯下降。為了更進一步的探討IL-8基因敲除對腫瘤干細胞的干細胞特性如自我更新和體外成瘤能力的影響，通過懸浮細胞成球和克隆形成實驗，我們發(fā)現(xiàn)沉默IL-8基因，能顯著抑制ALDH+細胞的自我更新和成瘤能力。

腫瘤干細胞能高表腫瘤耐藥相關基因，因此對常規(guī)化療藥物并不敏感。通過細胞活性檢測，IL-8基因沉默的前列腺癌干細胞對多西他賽的敏感性顯著增強。

PI3K/Akt信號通路在維持前列腺癌干細胞的穩(wěn)定性中起到非常重要的作用[7]，同時PI3K/Akt也是IL-8參與腫瘤細胞的生存、血管生成和細胞遷徙的重要的下游通路[8]。我們發(fā)現(xiàn)，沉默IL-8基因，抑制了Akt的激活。這說明PI3K/Akt信號通路是IL-8參與維持激素非依賴前列腺癌干細胞穩(wěn)定性的通路之一。

綜上所述，沉默腫瘤細胞IL-8基因，能顯著的清除激素非依賴前列腺癌腫瘤干細胞，明顯抑制腫瘤干細胞的自我更新和成瘤能力，增加其對多西他賽的化療敏感性。其機制可能是通過抑制PI3K/Akt通路。這個實驗的結果證明IL-8基因沉默能靶向清除激素非依賴前列腺癌干細胞，增加對西他賽的化療敏感性，為前列腺癌的臨床治療提供參考。

參考文獻

[1]Murphy C,Mcgurk M,Pettigrew J,et al.Nonapical and cytoplasmic expression of interleukin-8,CXCR1,and CXCR2 correlates with cell proliferation and microvessel density in prostate cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2005,11(11):4117-4127.

[2]Park SY,Han J,Kim JB,et al.Interleukin-8 is related to poor chemotherapeutic response and tumourigenicity in hepatocellular carcinoma〔J〕.Eur J Cancer，2014,50(2):341-350.

[3]Infanger DW,Cho Y,Lopez BS,et al.Glioblastoma stem cells are regulated by interleukin-8 signaling in a tumoral perivascular niche〔J〕.Cancer Res，2013,73(23):7079-7089.

[4]Ginestier C,Liu S,Diebel ME,et al.CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts〔J〕.J Clin Invest，2010,120(2):485-497.

[5]Li B,Cheng XL,Yang YP,et al.GRP78 mediates radiation resistance of a stem cell-like subpopulation within the MCF-7 breast cancer cell line〔J〕.Oncol Rep，2013,30(5):2119-2126.

[6]van den Hoogen C,van der Horst G,Cheung H,et al.High aldehyde dehydrogenase activity identifies tumor-initiating and metastasis-initiating cells in human prostate cancer〔J〕.Cancer Res，2010,70(12):5163-5173.

[7]Dubrovska A,Kim S,Salamone R J,et al.The role of PTEN/Akt/PI3K signaling in the maintenance and viability of prostate cancer stem-like cell populations〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2009,106(1):268-273.

[8]Waugh DJ,Wilson C.The interleukin-8 pathway in cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2008,14(21):6735-6741.

(編輯：吳小紅)

Effect of Interleukin-8 Silencing on Androgen-independent Prostate Cancer Stem Cells

SUNMengkui，ZHANGJiheng,CUIYun,etal.PekingUniversityFirstHospital，Beijing,100034

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of IL-8 silencing via small interfering RNA on androgen-independent prostate cancer stem cells and drug sensitive.MethodsDU145 cells transfected with different concentration of IL-8 siRNA were collected.The percentage of ALDH+cells were detected by flow cytometry.The sphere formation rate and cloning efficiency were determined by sphere formation assay and clonogenic assay.The viability of cells was detected by CCK-8 assay.The phosphorylation of Akt was evaluated by Western blot.ResultsThe percentage of ALDH+cells were declined under different concentration of IL-8 siRNA in DU145 cells.Sphere formation rate and cloning efficiency of prostate cancer stem cells were decreased by siRNA.The viability of IL-8 silencing DU145 cells was significantly suppressed compared with control groups and the Akt phosphorylation was activated.ConclusionIL-8 siRNA can eliminate androgen-independent prostate cancer stem cells and suppresses the self-renew and clonogenic capacity of prostate cancer stem cells.IL-8 silencing sensitizes prostate cancer stem cells to docetaxel and inactivates the Akt pathway.

【Key words】IL-8；DU145；Cancer stem cell；Akt

(收稿日期2015-03-19修回日期 2015-12-12)

中圖分類號：R737.25

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)02-0191-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.02.005

通訊作者：金杰