miRNA-34a對人結腸癌細胞HCT116增殖及侵襲轉移的影響

莊　彪　閔志均　王廷峰　張　鵬　倪　熊　瞿惠龍　丁育明

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miRNA-34a對人結腸癌細胞HCT116增殖及侵襲轉移的影響

莊彪閔志均王廷峰張鵬倪熊瞿惠龍丁育明

【摘要】目的研究微小RNA-34a(microRNA-34a，miR-34a)在人結腸癌細胞株HCT116中的過表達對細胞增殖和侵襲的影響及其機制。方法設計合成并構建攜帶綠色熒光蛋白 (GFP)的miR-34a真核表達載體，脂質體法穩定轉染HCT116細胞。通過Realtime PCR驗證轉染后miR-34a的表達變化。MTT法檢測轉染前后HCT116細胞增殖能力變化，Transwell法檢測轉染前后HCT116細胞侵襲能力改變，western blot檢測目的蛋白的表達。結果miR-34a轉染HCT116細胞后其表達量增加到(7.32±1.34)倍，而HCT116細胞增殖能力也受到顯著抑制，下降到(0.49±0.10)；Bcl-2蛋白受到miR-34a表達的抑制，而BAX的表達則受到miR-34a表達的增強；HCT116細胞侵襲能力在miR-34a過表達后顯著增強，相應的MMP-2和MMP-9表達也出現顯著增強。陰性對照組與空白對照組比較無顯著性差異。結論miR-34a的過表達能夠抑制人結腸癌細胞HCT116的增殖及侵襲轉移，與調控Bcl-2/BAX和MMP-2和-9蛋白的表達密切相關。

【關鍵詞】人結腸癌細胞；miRNA-34a；增殖；侵襲

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:179～182)

結腸癌(cancer of colon)作為中國最常見的消化道腫瘤之一，其發病率占胃腸道腫瘤的第3位。流行病學調查研究顯示，中國的結腸癌發病率呈逐年上升趨勢，與社會環境、生活方式和遺傳等因素密切相關。深入探究結腸癌的病因和機制，對結腸癌的早期診斷、臨床治療及預后均有顯著意義。微小 RNA(microRNA，miRNA)是一類在進化上結構高度保守的內源性非編碼RNA，近年來大量研究早已證實，miRNA在多種惡性腫瘤的病理進程中起到了極為重要的調控作用[1]。其中MicroRNA-34a(miR-34a)能夠作為抑癌基因p53的效應分子從而抑制多種癌細胞的增殖[2]，但對于miR-34a在結腸癌中的作用和機制研究仍相對空白，本研究通過構建 miR-34a表達載體并轉染人結腸癌細胞HCT116，研究miRNA-34a的表達在結腸癌中的增殖及侵襲轉移的作用，并探討其作用機制。

1材料與方法

1.1　細胞株與主要試劑

人結腸癌細胞株HCT116購自中國科學院細胞庫，高糖DMEM培養基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素等細胞培養試劑購自GIBCO公司，miRNA提取試劑盒購自QIAGEN公司，Real-time PCR Taqman 試劑購自Takara公司，MTT試劑購自Sigma公司，miR-34a真核表達載體(GAUGUUCUAUUGAAGAGUGUUUG)和陰性對照miR-34a-none control (NC:GGACACGAAATCTATGCGCGTG)及攜帶GFP熒光蛋白表達的重組質粒由上海吉瑪基因公司設計并合成，轉染試劑 lipofectmin2000 購自 Invitrogen公司，Western blot相關試劑(上樣緩沖液，蛋白marker，電泳液和轉膜液，顯色液)購自碧云天公司，第一抗體和第二抗體購自Cell signalling Technology公司，其他常用試劑購自Sigma公司。

1.2　實驗方案

1.2.1細胞培養人結腸癌細胞株HCT116培養于含10%胎牛血清、1 000 U/ml青鏈霉素的高糖DMEM培養基，放置于37 ℃，5% CO2的恒溫細胞培養箱內，每2～3天更換培養液，待細胞融合>80%后使用胰蛋白酶消化細胞，種板培養或傳代。

1.2.2miR-34a轉染HCT116細胞消化重懸后，使用DMEM完全培養基稀釋到105個/ml，將2 ml細胞種到6孔板中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養箱內24 h后，待細胞融合>50%后更換無血清培養基，進行轉染。提前按照試劑說明書制備轉染溶液，在500 μl DMEM 中加入 5 μg 質粒混勻，室溫孵育 5 min；在DMEM中再加入 10 μl 脂質體 lipofectmin 2000 混勻，室溫孵育 5 min；將上述2種稀釋液混勻，室溫孵育 20 min。將混合物加入6 孔板中，混勻后繼續培養，轉染后12 h后更換DMEM完全培養液，置于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養箱內培養用于后續實驗。

1.2.3miR-34a表達檢測培養HCT116細胞使用QIAGEN公司miRNA提取試劑盒提取總miRMA后，使用TaqMan MicroRNA 逆轉錄試劑盒將上述提取的miRNA 逆轉錄成 cDNA，反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min；以 TaqMan MicroRNA 檢測試劑盒對上述制備得到的cDNA進行 real-time PCR 反應，反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s 及 60 ℃ 1 min，共 40個循環。PCR 完成后，在羅氏LC480軟件上分析基因的擴增情況，得到相應的 Ct 值。以 U6為內參來校正PCR 模板的拷貝數，每組設3個復孔，基因相對表達量采用 2-ΔΔCt方法計算。

1.2.4Western blotmiR-34a轉染組、陰性對照組和空白對照組的HCT116 細胞在培養24 h后，去除培養基，加入預冷的PBS洗滌細胞，加入10 μl的RIPA裂解液，10 min后提取總蛋白，BCA法蛋白定量蛋白濃度，各組取50 μg蛋白進行10%SDS-PAGE電泳。電泳結束后轉膜到PVDF膜，用5% milk-TBS將膜封閉1 h，加入相應的第一抗體，靜置于4 ℃過夜。次日使用TBST漂洗，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗室溫孵育1 h，DAB顯影拍照。

1.2.5MTT 檢測細胞的增殖miR-34a轉染組、陰性對照組和空白對照組的HCT116 細胞以105/ml 密度接種于 96孔板中，加入200 μl DMEM完全培養液，轉染后置于 37 ℃、5% CO2孵箱中分別培養 24、36、 48 h和72 h后，去除培養液，加入10 μl/每孔的MTT 后在37 ℃細胞培養箱內繼續孵育1 h 后，觀察到明顯的顏色變化后再用酶標儀讀取每孔的吸光度值，計算細胞增殖抑制率。

1.2.6Transwell腫瘤細胞侵襲實驗檢測細胞侵襲能力miR-34a轉染組、陰性對照組和空白對照組的HCT116 細胞分別接種于6孔板中。本研究使用8 μm孔徑的Corning小室檢測HCT116細胞的侵襲能力。單層Matrigel膠提前包被小室濾膜，在上室孔中加入轉染組、陰性對照組和空白對照組的HCT116 細胞(105個)，在下室中加入DMEM完全培養基，靜置于37 ℃培養箱內培養24 h后。去除培養基，使用4%多聚甲醛固定，蘇木精染色，置于顯微鏡下隨機選取5個視野進行細胞計數。細胞侵襲率/%=(穿透細胞數/空白對照組穿透細胞數)×100% 。

1.3　統計學分析

數據分析應用Graphpad Prism 5.0統計軟件完成，數據采用MEAN±SEM 表達，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05或P<0.01表示差異具有統計學意義。

2結果

2.1　miR-34a轉染HCT116細胞上調miR-34a的表達

在miR-34a表達質粒轉染HCT116細胞24 h后，熒光檢測結果可見，miR-34a轉染的HCT116細胞中可見攜帶GFP綠色熒光蛋白，表明轉染成功。提取細胞總miRNA進行Reltime PCR驗證，結果顯示，轉染后的HCT116細胞的miR-34a表達水平增加了(7.32±1.34)倍(與空白對照組相比，P<0.001)，而陰性對照組與空白對照組的miR-34a表達水平比較無顯著性差異，其中陰性對照組為(0.99±0.01)，空白對照組為(1.00±0.03)(圖1)。因此可以明確，miR-34a表達質粒轉染HCT116細胞后能夠顯著上調miR-34a的表達。

圖1　Realtime PCR檢測HCT116細胞中miR-34a表達

2.2　miR-34a 轉染抑制HCT116細胞的增殖

對轉染miR-34a后的HCT116細胞增殖能力進行檢測。MTT檢測結果顯示，miR-34a過表達的HCT116細胞的增殖能力受到顯著抑制，下降到(0.49±0.10)(與空白對照組相比，P<0.001)，而陰性對照組與空白對照組miR-34a表達水平比較無顯著性差異，其中陰性對照組為(1.00±0.08)，空白對照組為(0.99±0.06)(圖2)，表明miR-34a與HCT116細胞的增殖能力密切相關。

圖2　MTT法檢測結果

2.3　miR-34a轉染對Bcl-2和BAX蛋白表達的影響

Bcl-2和BAX蛋白是細胞凋亡分子機制研究的重要靶分子。Western blot結果顯示，與空白對照組及陰性對照組相比，miR-34a轉染組的Bcl-2條帶灰度明顯降低，而BAX條帶灰度則顯著增強，但空白對照組和陰性對照組相比無顯著差異(圖3)，表明miR-34a可能通過調控Bcl-2和BAX蛋白表達而抑制HCT116細胞的增殖。

圖3　Western blot檢測結果

2.4　miR-34a轉染對HCT116侵襲能力的影響

Transwell檢測結果顯示，miR-34a過表達的HCT116細胞的侵襲能力受到顯著抑制，下降到(62.67±8.23)%(與空白對照組相比，P<0.001)，而陰性對照組與空白對照組miR-34a表達比較無顯著性差異，其中陰性對照組為(93.32±10.20)%，空白對照組為(100.50±8.13)%(圖4)，表明miR-34a可能參與了HCT116細胞的侵襲過程。

圖4　Transwell法檢測結果

2.5　miR-34a轉染對MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的活性與結腸癌細胞的侵襲轉移能力密切相關。Western blot結果顯示，與空白對照組及陰性對照組相比，miR-34a轉染組的MMP-2和MMP-9的條帶灰度明顯降低，其中MMP-9的條帶灰度減弱更為明顯，但空白對照組與陰性對照組相比，MMP-2和MMP-9無顯著差異(圖5)，表明miR-34a可能通過調控MMP-2和MMP-9的蛋白表達而抑制HCT116細胞的侵襲轉移。

圖5　Western blot檢測結果

3討論

結腸癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，全球每年新發病例多達800萬人，具有浸潤性生長、惡性程度高和復發率高的特點，而其病因和機制尚未得到明確的認識，給治療帶來了極大的困難[3]。進一步研究揭示結腸癌發病的分子機制和藥物靶點，具有重要的社會和經濟價值。

MicroRNA是1種近年逐漸明確的內源性非編碼的單鏈小分子RNA，其結構在進化上高度保守，能夠通過與目標基因的轉錄mRNA的3’-UTR端特異性配對結合而發生結構改變，從而促進目標基因mRNA的降解或抑制其翻譯轉錄，從而達到調控靶蛋白表達的作用[4]。近年的大量研究表明，存在多種不同功能的miRNA位于腫瘤相關基因組的染色體區域，并能通過與目的基因的相互作用而對腫瘤細胞的惡性生物學行為產生不同的調控作用，尤其是與癌細胞的增殖和侵襲轉移密切相關[5-6]。miRNA 的功能學研究為多種腫瘤，包括結腸癌的診斷和治療提供了新的研究思路和方向，并且通過應用miRNA的表達載體或相應的反義miRNA 來提高或降低特定miRNA 的表達，從而達到抑制癌細胞生長轉移的作用已取得了一定的研究成果[7]。已有研究明確，在結腸癌患者的病變組織中能夠檢測到多種miRNA出現差異性表達，例如Wang P等的研究顯示，miRNA-21靶向調控Cdc25a的表達而對結腸癌細胞的增殖和周期產生抑制作用[8]，而miRNA-143和-145在結腸癌細胞增殖和化療敏感性等方面的作用已經相對明確，成為具有潛在的診斷和治療價值的靶點[9]。早有研究顯示，miR-34a能夠促進膠質瘤細胞的凋亡，阻滯細胞周期于G1期而抑制其增殖，同時也能抑制其侵襲轉移能力[10]，此外miR-34a在前列腺癌、肝癌和肺癌等多種腫瘤中展示出多種不同機制的調控作用，而被認為是具有重要價值的腫瘤抑制因子[11-13]，但是miR-34a 在結腸癌中的作用研究目前尚相對較少。

為了探討miR-34a的表達在結腸癌中的作用，本研究根據microRNA作用原理設計合成了miR-34a的真核表達載體并轉染HCT116細胞，采用real-time PCR 檢測結果明確了轉染細胞后miR-34a表達顯著上升，在此基礎上我們發現，miR-34a的過表達抑制了HCT116細胞的增殖和侵襲轉移。上述結果表明，miR-34a在HCT116細胞中起到抑制腫瘤相關基因的作用，提示miR-34a可作為結腸癌基因治療的潛在靶點，這與其他的研究結果一致[14]。一些研究也發現，部分miRNA具有調控部分與癌細胞增殖和侵襲轉移相關的靶點蛋白，例如miRNA-146b能夠通過靶向調控MMPs的表達而抑制膠質瘤細胞的侵襲能力[15]。因此我們進一步研究了與細胞增殖和轉移密切相關的蛋白表達，而與前面的研究結果相一致的，Bcl-2表達被抑制而BAX表達出現上調，癌細胞轉移相關的MMP-2和MMP-9的表達受到抑制，提示miR-34a通過調控Bcl-2/BAX和MMP-2和-9蛋白的表達而降低了結腸癌細胞的增殖和侵襲轉移的能力。

綜上所述，本研究證實miR-34a的過表達能夠抑制人結腸癌HCT116細胞的增殖和侵襲轉移，這一作用可能是通過調控Bcl-2/BAX和MMP-2和-9蛋白的表達相關，初步揭示了miR-34a在結腸癌的治療和診斷中的潛在價值，為后續的深入研究提供理論和實驗基礎。

參考文獻

[1]Watanabe T,Itabashi M,Shimada Y,et al.Japanese Society for Cancer of the Colon and Rectum (JSCCR) guidelines 2010 for the treatment of colorectal cancer〔J〕.Int J Clin Oncol,2012,17(1):1-29.

[2]Raver-Shapira N,Marciano E,Meiri E,et al.Transcriptional activation of miR-34a contributes to p53-mediated apoptosis〔J〕.Mol cell,2007,26(5):731-743.

[3]B?ckelman C,Engelmann BE,Kaprio T,et al.Risk of recurrence in patients with colon cancer stage Ⅱ and Ⅲ:A systematic review and meta-analysis of recent literature〔J〕.Acta Oncol,2015,54(1):5-16.

[4]Iorio MV,Croce CM.MicroRNA dysregulation in cancer:diagnostics,monitoring and therapeutics.A comprehensive review〔J〕.EMBO Mol Med,2012,4(3):143-159.

[5]Rokavec M,?ner MG,Li H,et al.IL-6R/STAT3/miR-34a feedback loop promotes EMT-mediated colorectal cancer invasion and metastasis〔J〕.J Clin Invest,2014,124(4):1853-1867.

[6]Calin GA,Croce CM.MicroRNA-cancer connection:the beginning of a new tale〔J〕.Cancer Res,2006,66(15):7390-7394.

[7]Pereira DM,Rodrigues PM,Borralho PM,et al.Delivering the promise of miRNA cancer therapeutics〔J〕.Drug Discov Today,2013,18(5):282-289.

[8]Wang P,Zou F,Zhang X,et al.microRNA-21 negatively regulates Cdc25A and cell cycle progression in colon cancer cells〔J〕.Cancer Res,2009,69(20):8157-8165.

[9]Akao Y,Nakagawa Y,Naoe T.MicroRNA-143 and-145 in colon cancer〔J〕.DNA Cell Biol,2007,26(5):311-320.

[10]Guessous F,Zhang Y,Kofman A,et al.microRNA-34a is tumor suppressive in brain tumors and glioma stem cells〔J〕.Cell Cycle,2010,9(6):1031-1036.

[11]Liu C,Kelnar K,Liu B,et al.The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44〔J〕.Nat Med,2011,17(2):211-215.

[12]Li N,Fu H,Tie Y,et al.miR-34a inhibits migration and invasion by down-regulation of c-Met expression in human hepatocellular carcinoma cells〔J〕.Cancer Lett,2009,275(1):44-53.

[13]Gallardo E,Navarro A,Violas N,et al.miR-34a as a prognostic marker of relapse in surgically resected non-small-cell lung cancer〔J〕.Carcinogenesis,2009,30(11):1903-1909.

[14]Tazawa H,Tsuchiya N,Izumiya M,et al.Tumor-suppressive miR-34a induces senescence-like growth arrest through modulation of the E2F pathway in human colon cancer cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(39):15472-15477.

[15]Xia H,Qi Y,Ng SS,et al.microRNA-146b inhibits glioma cell migration and invasion by targeting MMPs〔J〕.Brain Res,2009,1269:158-165.

(編輯：吳小紅)

Effects of miRNA-34a on Cell Proliferation and Invasion in Human Colon

Cancer Cell HCT116

ZHUANGBiao,MINZhijun,WANGTingfeng,etal.ShanghaiPudongHospital,Shanghai,201300

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of microRNA-34a (miR-34a) overexpression on cell proliferation and invasion in human colon cancer cell line HCT116.MethodsA portable green synthesis fluorescent protein (GFP) of miR-34a eukaryotic expression vector was designed and established to stably transfect HCT116 cells.Realtime PCR was used to verify the expression of miR-34a after expression vector transfection.MTT assay was used to determine the changes of HCT116 cell proliferation.Transwell assay was performed to measure the cell invasion ability of HCT116 cells.ResultsAfter transfection of miR-34a into HCT116 cells,the expression of miR-34a increased by(7.32±1.34) folds and cell proliferation ability was significantly inhibited,which was reduced to(0.49±0.10) compared with the control group.Bcl-2 protein expression was inhibited by miR-34a transfection,but the expression of BAX was enhanced by miR-34a transfection.The invasion of HCT116 cells was also significantly increased by miR-34a transfection,which was accompanied by MMP-2 and MMP-9 up-regulation.There was no significant difference in the negative control group and the control group.ConclusionOverexpression of miR-34a can inhibit the proliferation and invasion in human colon cancer cells HCT116,and it is closely correlated with the regulation of Bcl-2/BAX and the expression of MMP-2 and-9 proteins.

【Key words】Human colon cancer cells;miRNA-34a;Proliferation;Invasion

(收稿日期2015-03-23修回日期 2015-11-20)

中圖分類號：R735.3+5

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)02-0179-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.02.002

通訊作者：莊彪

基金項目：上海市浦東新區衛生和計劃生育委員會科技發展專項基金(編號：PW2014A-28)
作者單位:201300上海市浦東醫院