p-mTOR、eIF4E、p-4EBP1在侵襲性垂體瘤中的表達及相關性研究

李　鵬，張慶九，李旭蕊，馬　法，劉　嵐，李曉燕(.河北省石家莊市第二醫院神經外科，河北 石家莊 000；2.河北醫科大學第二醫院神經外科，河北 石家莊 00000；.河北省石家莊市第二醫院重癥醫學科，河北 石家莊 000；.河北省石家莊市裕華區婦幼保健站婦產科，河北 石家莊 00000；.河北醫科大學第一醫院心內科，河北 石家莊 000)

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·論著·

二醫院主治醫師，醫學碩士，從事神經外科疾病診治研究。

p-mTOR、eIF4E、p-4EBP1在侵襲性垂體瘤中的表達及相關性研究

李鵬1，張慶九2*，李旭蕊3，馬法3，劉嵐4，李曉燕5(1.河北省石家莊市第二醫院神經外科，河北 石家莊 050051；2.河北醫科大學第二醫院神經外科，河北 石家莊 050000；3.河北省石家莊市第二醫院重癥醫學科，河北 石家莊 050051；4.河北省石家莊市裕華區婦幼保健站婦產科，河北 石家莊 050000；5.河北醫科大學第一醫院心內科，河北 石家莊 050031)

[摘要]目的觀察磷酸化的哺乳動物雷帕霉素蛋白(phosphorylated mammal target of rapamycin,p-mTOR)、真核細胞翻譯起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E)和磷酸化的真核細胞翻譯起始因子4E 結合蛋白(phosphorylated eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1,p-4EBP1)在侵襲性垂體瘤中的表達并進行相關性分析。方法選擇侵襲性垂體瘤患者52例和非侵襲性垂體瘤患者49例，應用免疫組織化學方法檢測p-mTOR、eIF4E和p-4EBP1的表達，比較2組p-mTOR、eIF4E和p-4EBP1的表達差異并分析三者在侵襲性垂體瘤中的相關性。結果在侵襲性垂體瘤中p-mTOR、eIF4E 和 p-4EBP1的表達陽性率分別為73.08%、63.46%和67.31%，高于非侵襲性垂體瘤的48.98%、38.78%及36.73%，差異有統計學意義(P<0.05)；在侵襲性垂體瘤中p-mTOR、eIF4E與p-4EBP1表達呈正相關(r=0.520，P=0.000；r=0.360，P=0.041)，eIF4E 與p-4EBP1表達亦呈正相關(r=0.320，P=0.019)。結論在侵襲性垂體瘤中p-mTOR、eIF4E和p-4EBP1表達陽性率均高于非侵襲性垂體瘤，且在侵襲性垂體瘤中p-mTOR、eIF4E、p-4EBP1表達分別呈正相關。p-mTOR、eIF4E和p-4EBP1在垂體瘤的侵襲過程中可能發揮著促進其侵襲的作用。

[關鍵詞]垂體腫瘤；他克莫司結合蛋白質類；真核細胞起始因子類

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.02.006

垂體瘤是一種常見的顱內腫瘤，多為良性，但有一部分垂體瘤呈侵襲性生長，破壞局部及臨近的結構，并對局部組織浸潤，手術難度高，不易切除，容易復發。目前在細胞信號傳導途徑的分子機制研究過程中，發現細胞信號傳導機制對腫瘤細胞的侵襲、轉移、逃避凋亡等起著重要的促進作用，如磷酸化的哺乳動物雷帕霉素蛋白( phosphorylated mammal target of rapamycin,p-mTOR)、真核細胞翻譯起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E)和磷酸化的真核細胞翻譯起始因子4E 結合蛋白(phosphorylated eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1,p-4EBP1)等。本研究觀察p-mTOR、eIF4E、p-4EBP1在侵襲性垂體瘤中的表達并分析其相關性，旨在探討p-mTOR、eIF4E和p-4EBP1在垂體瘤侵襲過程中是否有促進腫瘤侵襲的作用，從而進一步為侵襲性垂體瘤的靶向治療提供新的方向。報告如下。

1資料與方法

1.1標本來源選擇2012年8月—2014年2月河北醫科大學第二醫院神經外科收治的垂體瘤患者101例，男性44例，女性57例，年齡24~73歲，平均(40.45±1.92)歲。均經手術切除垂體瘤并留取標本。按是否符合侵襲性垂體瘤的判斷標準[1]分為侵襲性垂體瘤組52例和非侵襲性垂體瘤組49例。侵襲性垂體瘤組男性23例，女性29例，年齡29~73歲，平均(42.54±1.89)歲；非侵襲性垂體瘤組男性21例，女性28例，年齡24~70歲，平均(39.58±2.32)歲。2組性別、年齡差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2試劑兔抗人p-mTOR多克隆抗體、eIF4E多克隆抗體和p-4EBP1多克隆抗體均購自美國Bioworld生物公司。二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB) 顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。鏈酶菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(streptomycin peroxidel,SP) 試劑盒購自河北博海生物工程開發有限公司。山羊抗兔IgG免疫二抗均購自武漢博士德公司。

1.3方法采用4%多聚甲醛將手術垂體瘤標本進行固定，并依次經過各濃度梯度的乙醇30 min，二甲苯及石蠟各30 min，依次浸泡后包埋制成組織塊，切成厚度為5 μm的切片60 ℃過夜，經過二甲苯、乙醇脫蠟，自來水及磷酸緩沖液(phosphate belanced solution，PBS)沖洗2次，采用3%甲醇雙氧水滅活內源性過氧化物酶，經抗原修復和血清封閉，滴加一抗、二抗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素復染，封片。結果判斷：記錄每高倍視野中染色陽性百分率，無陽性細胞為0分，1%~10%為1分，11%~50%為2分，51%~80%為3分，>80%為4分。顯色度按細胞有無顯色及染色深度計分，細胞無顯色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩者相乘作為最后得分。①0分為陰性(-)；②1~4 分為弱陽性(+)；③5~8分為陽性(++)；④9~12分為強陽性(+++)。

1.4統計學方法應用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行處理。計數資料比較采用χ2檢驗；相關性采用Spearman等級相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1p-mTOR、eIF4E、p-4EBP1在侵襲性垂體瘤和非侵襲垂體瘤中表達p-mTOR、eIF4E、p-4EBP1在侵襲性垂體瘤中的表達陽性率高于非侵襲性垂體瘤，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2侵襲性垂體瘤中p-mTOR、eIF4E、p-4EBP1的相關性分析侵襲性垂體瘤52例中，p-mTOR陽性38例，eIF4E陽性33例，p-4EBP1陽性35例。Spearman等級相關分析顯示，在侵襲性垂體瘤中p-mTOR、eIF4E與p-4EBP1分別呈顯著正相關(rs=0.520，P=0.000；rs=0.360，P=0.041)，eIF4E 與p-4EBP1亦呈顯著正相關(rs=0.320，P=0.019)。見表2。

2.3p-mTOR、eIF4E、p-4EBP1在侵襲性垂體瘤和非侵襲性垂體瘤中免疫組織化學結果p-mTOR、eIF4E、p-4EBP1大部分在真核細胞質中存在，少數存在于細胞核中。p-mTOR、eIF4E、p-4EBP1在侵襲性垂體瘤中和非侵襲性垂體瘤中均有表達，但在侵襲性垂體瘤中表達強度(評分)更高，染色細胞百

分率更多，細胞染色程度加深，p-mTOR、eIF4E、p-4EBP1在侵襲性垂體瘤中的表達顯著高于非侵襲性垂體瘤(圖1)。

表1p-mTOR、eIF4E、p-4EBP1在侵襲性垂體瘤與非侵襲性垂體瘤中的表達比較

Table 1　The Comparison the expression of p-mTOR，eIF4E and p-4EBP1 between invasive pituitary adenomas and non- invasive pituitary adenomas(例數，%)

表2p-mTOR、eIF4E、p-4EBP1在侵襲性垂體瘤中的相關性分析

Table 2　The correlation analysis of p-mTOR，eIF4E and p-4EBP1 in invasive pituitary adenomas(例數)

圖1p-mTOR、eIF4E、p-4EBP1在侵襲性垂體瘤和非侵襲垂體瘤中的表達 (免疫組織化學 ×400)

A.p-mTOR在侵襲性垂體腺瘤表達(++)；B.p-mTOR在非侵襲性垂體腺瘤表達(+)；C.eIF4E侵襲性垂體腺瘤表達(++)；D.eIF4E在非侵襲性垂體腺瘤表達(+)；E. p-4EBP1在侵襲性垂體腺瘤表達(++)；F.p-4EBP1在非侵襲性垂體腺瘤表達(+)

Firgure 1The expression of p-mTOR,eIF4E and p-4EBP1 in the invasive pituitary adenomas and non-invasive pituitary adenomas(SP ×400)

3討論

哺乳動物雷帕霉素蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/鼠類胸腺瘤病毒致癌基因同源物(v-akt murine thymoma viral oncogene homolo,AKT)細胞信號轉導通路激活，磷酸化后形成p-mTOR。p-mTOR進一步激活其下游的2個分子，即真核細胞翻譯起始因子4E 結合蛋白1和核糖體蛋白p70s6k，使其磷酸化[2]。eIF4E和4EBP1存在于真核細胞質中，一部分存在于細胞核中[3]，是真核細胞翻譯起始因子復合體中的亞單位，與mRNA帽結構結合啟動真核細胞起始翻譯，促進細胞的翻譯，正常情況下4EBP1與eIF4E結合，eIF4E濃度低，抑制細胞的翻譯起始[4]，對細胞生長起到負調控作用，但通過PI3K/AKT通路激活mTOR，p-mTOR使4EBP1磷酸化，p-4EBP1與eIF4E分離，弱化對eIF4E的抑制作用，促進蛋白翻譯。

近年來，隨著分子機制水平研究的發展，顯示p-mTOR、p-4EBP1和eIF4E在促進腫瘤細胞的生長、新生血管的生成、侵襲、浸潤、轉移等方面起到重要的促進作用。陳云楊等[5]和張禹等[6]研究顯示通過p-mTOR激活其下游分子4EBP1，從而抑制不依賴p53的細胞凋亡，上調血管內皮生長因子表達，促進腫瘤的生長及新生血管的生成。p-mTOR、p-4EBP1和eIF4E在多種腫瘤細胞中高表達[7]，而且與腫瘤分級呈顯著相關性。陳業剛等[8]指出p-mTOR會引起膀胱上皮增生活躍，p-mTOR是膀胱癌復發的一種獨立因素。p-4EBP1在浸潤性乳腺癌細胞漿中表達升高與乳腺癌密切相關[9]。有研究表明eIF4E與宮頸癌的病理分級存在密切相關[10]。劉月平等[11]研究顯示eIF4E在食管癌中高表達，且與食管癌分期相關。同樣，在腦膠質瘤中顯示出p-4EBP1的高表達[3,12]及mTOR在腦膠質瘤[13-14]、侵襲性垂體瘤[15]存在高表達。故推測p-mTOR、p-4EBP1和eIF4E同時在侵襲性垂體瘤中存在高表達，并具有相關性。

本研究結果顯示，在侵襲性垂體瘤中p-mTOR、eIF4E、p-4EBP1的陽性率分別為73.08%、63.46%、67.31%，均明顯高于非侵襲性垂體瘤中的48.98%、38.78%及36.73%。表明p-mTOR、eIF4E、p-4EBP1在侵襲性垂體瘤中高表達，可能與三者在腫瘤細胞中促進蛋白翻譯、抑制細胞凋亡、加速有絲分裂等有關。另一方面，本研究結果顯示，在侵襲性垂體瘤中，p-mTOR、eIF4E、p-4EBP1在侵襲性垂體瘤中分別呈顯著正相關(P<0.05)。提示在侵襲性垂體瘤中p-mTOR增多，使p-4EBP1增多，4EBP1與eIF4E分離，從而eIF4E升高。

綜上所述，在侵襲性垂體瘤中p-mTOR、eIF4E、p-4EBP1可能同時高表達，且三者之間均呈正相關，對垂體瘤的侵襲發展有一定的促進作用，這為侵襲性垂體瘤的治療提供了一種新的靶向治療方向。

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(本文編輯：趙麗潔)

The expression and correlation of p-mTOR,eIF4E and p-4EBP1 in invasive pituitary adenomas

LI Peng1，ZHANG Qing-jiu2*，LI Xu-run3，MA Fa3，LIU Lan4，LI Xiao-yan5

(1.Department of Neurosurgery，the Second Hospital of Shijiazhuang City，Hebei Province，Shijiazhuang

050051，China；2.Department of Neurosurgery，the Second Hospital of Hebei Medical University，

Shijiazhuang 050000，China；3.Department of Critical Care Midicine，the Second Hospital

of Shijiazhuang City，Hebei Province，Shijiazhuang 050051，China；4.Department of

Gynaecology and Obstetrics，Yuhuaqu Women and Children Health Station of

Shijiazhuang City，Hebei Province，Shijiazhuang 050000，China；

5.Department of Cardiology，the First Hospital of Hebei

Medical University，Shijiazhuang 050031，China)

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the expression and correlation of phosphorylated mammal of rapamycin(p-mTOR), eukaryotic initiation factor 4E(eIF4E) and phosphorylated eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1(p-4EBP1) in invasive pituitary adenomas. MethodsFifty-two patients of invasive pituitary adenomas and forty-nine patients of non-invasive pituitary adenomas were selected in this study. The expressions of p-mTOR, eIF4E and p-4EBP1were respectively detected in invasive pituitary adenomas group and non-invasive pituitary adenomas group by immunohistochemistry method. The differences of p-mTOR, eIF4E and p-4EBP1 between the two groups were compared, and the correlation of p-mTOR, eIF4E and p-4EBP1 in invasive pituitary adenomas was studied. ResultsThe positive rate of the expression of p-mTOR, eIF4E and p-4EBP1 was respectively higher in invasive pituitary adenomas group(73.08%, 63.46%, 67.31%) than that in non-invasive pituitary adenomas(48.98%, 38.78%, 36.73%). The differences between two groups were statistically significant(P<0.05). Positive correlation was founded between the expression of p-mTOR, eIF4E in invasive pituitary adenomas(r=0.520, P=0.000), and positive correlation was also founded between the expression of p-mTOR and p-4EBP1 in invasive pituitary adenomas(r=0.360, P=0.041). In addition, positive correlation was founded between eIF4E and p-4EBP1 in invasive pituitary adenomas(r=0.320, P=0.019). ConclusionThe expression levels of p-mTOR, eIF4E and p-4EBP1 of the invasive pituitary adenomas were higher than that of the non-invasive pituitary adenomas. Positive correlation was founded among p-mTOR, eIF4E and p-4EBP1 in invasive pituitary adenomas. p-mTOR, eIF4E and p-4EBP1 in the pituitary adenoma may play an important role in the invasiveness of pituitary adenomas.

[Key words]pituitary neoplasms； tacrolimus binding proteins； eukaryotic initiation factors

[中圖分類號]R736.4

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)02-0147-04

通訊作者*

[作者簡介]李鵬(1980-)，男，遼寧錦州人，河北省石家莊市第

[收稿日期]2015-03-23；[修回日期]2015-12-11