河北漢族人群谷胱甘肽硫-轉移酶Z1的基因多態性研究

范志亮，馮曉娟，李春巖，尹少華，田新英*，任文博(.河北省邢臺市人民醫院神經內三科，河北 邢臺 0500；.河北醫科大學第二醫院神經內科，河北 石家莊 050000；.河北省邢臺市人民醫院超聲科，河北 邢臺 0500；.天津市第五中心醫院神經內科，天津 00000)

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·論著·

民醫院主治醫師，醫學碩士，從事運動神經元疾病和頭痛病診治研究。

河北漢族人群谷胱甘肽硫-轉移酶Z1的基因多態性研究

范志亮1，2，馮曉娟3，李春巖2，尹少華1，田新英2*，任文博4(1.河北省邢臺市人民醫院神經內三科，河北 邢臺 054001；2.河北醫科大學第二醫院神經內科，河北 石家莊 050000；3.河北省邢臺市人民醫院超聲科，河北 邢臺 054001；4.天津市第五中心醫院神經內科，天津 300000)

[摘要]目的探討河北漢族人群谷胱甘肽硫-轉移酶Z1(glutathione S-transferase zeta 1，GSTZ1)基因多態性的分布情況。方法應用聚合酶鏈式反應-限制性酶切片段長度多態性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法，對210例河北漢族正常人進行GSTZ1 Lys32Glu基因多態性分析。結果河北漢族人群GSTZ1 Lys32Glu基因多態性符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，具有代表性。河北漢族人群GSTZ1 Lys32Glu基因型頻率分布和等位基因頻率分布與伊朗人群、澳大利亞人群、德國人群、美國人群差異有統計學意義(P<0.05)；伊朗人群GSTZ1 Lys32Glu基因型頻率分布和等位基因頻率分布與澳大利亞人群、德國人群、美國人群差異有統計學意義(P<0.05)；澳大利亞人群、德國人群、美國人群GSTZ1 Lys32Glu基因型頻率分布和等位基因頻率分布差異無統計學意義 (P>0.05)。結論河北漢族人群GSTZ1 Lys32Glu基因型頻率分布和等位基因頻率有其獨特性。GSTZ1 Lys32Glu的基因多態性在地域和人種中的分布明顯不同。

[關鍵詞]基因；多態性；谷胱甘肽硫-轉移酶Z1；河北漢族

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.02.003

谷胱甘肽硫-轉移酶(glutathione S-transferases，GSTs)是體內Ⅱ相代謝酶家族的重要成員，在體內活性氧產物的代謝中發揮了重要的作用，并且是體內氧化/抗氧化系統的重要成員，可以保護機體免受氧化應激的損傷[1-2]。 GSTs基因多態性可能影響所編碼的酶的功能，可以導致機體對一些活性氧產物和毒素的敏感性的改變，引起DNA損傷，導致疾病的發生[3]。GSTs多態性與腫瘤、系統性紅斑狼瘡、白癜風、慢性阻塞性肺病、帕金森病等易感性的關系已成為近年來研究的熱點[4-5]。人類可溶性GSTs至少包括7 種,即alpa (A)、 mu (M)、pi (P)、theta (T)、zeta (Z)、sigma(S)、omega(O)。已證實GSTA1、GSTA2、GSTM1、GSTT1、GSTP1、GSTZ1 和GSTO1具有多態性，目前對GSTM1、GSTT1和GSTP1 的基因多態性研究較為深入，而對GSTZ1多態性的研究相對較少[6-7]。對我國GSTZ1基因多態性的分布鮮有報道。GSTZ1最常見多態性的是GSTZ1 Lys32Glu，導致A→G轉換[8]。本研究主要探討GSTZ1 Lys32Glu基因多態性在河北健康漢族人群中的分布，旨在了解疾病的發生機制,評估疾病發生的風險,篩檢高危人群,為疾病的治療及預防提供線索。

1資料與方法

1.1受試對象隨機選取2013年12月—2014年2月無直接血緣關系的健康河北漢族個體210例， 男性122例，女性88例，年齡22~72歲，平均(49.27±9.34)歲。納入標準：①漢族；②出生地及籍貫均為河北省；③定居河北省已三代及三代以上。排除標準：①罹患任何遺傳傾向性疾病；②在取樣當時，診斷出患有各種心腦血管疾病、腫瘤、精神異常及其他重大健康問題。

所有受試對象均知情并簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2方法本研究采用聚合酶鏈式反應-限制性酶切片段長度多態性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法[9]分析GSTZ1 Lys 32 Glu的基因多態性。

1.2.1DNA的提取血液樣品DNA通過北京天根公司血液基因組DNA提取試劑盒進行提取。①將-80 ℃凍存的抗凝血混勻，取300 μL放入1.5 mL離心管中，加入750 μL的細胞裂解液CL，顛倒混勻5次；②10 000 g離心1 min，棄上清，倒置于干凈吸水紙上停留2 min；③向此管中加入緩沖液FG和蛋白酶K的混合液151.5 μL，立即漩渦至溶液無團塊；56 ℃水浴10 min，其間顛倒混勻數次；④加入異丙醇150 μL，顛倒混勻，10 000 g離心3 min，棄上清，倒置于干凈吸水紙上停留2 min；⑤加入70%乙醇150 μL，漩渦振蕩5 s，10 000 g離心3 min，棄上清，倒置于干凈吸水紙上停留5 min，空氣干燥5 min；⑥加入洗脫緩沖液TB 200 μL，低速漩渦5 s，65 ℃水浴1 h，其間顛倒混勻數次助溶。最后保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2PCR擴增①設計引物(由上海生物工程技術有限公司合成):上游引物為，5′-TGACCACCCAGAAGTGTTAG-3′，下游引物為5′-AGTCCACAAGACACAGGTTC-3′。②PCR擴增體系：總體積20 μL,體系終濃度1×PCR 緩沖液,0.2 mmol/L dNTP,引物各300 pmol/ L,模板DNA(25~50 ng),TaqDNA 聚合酶0.5 U。③PCR反應條件:預變性95 ℃ 2 min,95 ℃變性20 s,65 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,共35個循環,最后72 ℃延伸3 min。

1.2.3PCR擴增產物鑒定取5 μL PCR反應產物加樣于3%瓊脂糖(1 μL Goldview Ⅰ型核酸染色劑)上，100 V電壓條件下，電泳40 min之后，用全自動凝膠成像分析系統掃描，目的條帶于310 bp處顯影。

1.2.4限制性片段長度多態性分析酶切反應總體積為20 μL，含10 μL PCR反應產物、10 U的限制性核酸內切酶Alw 26I、2 μL 10 ×buffer、7.6 μL超純去離子水。以雙蒸水代酶作為陰性對照，37 ℃酶切16 h。取酶切產物5 μL，加樣于3%瓊脂糖凝膠上，100 V電壓電泳40 min，再用全自動凝膠成像分析系統掃描。

1.2.5限制性片段長度多態性分析擴增產物經Alw26I酶酶切以后，電泳可見到185 bp、125 bp 2條條帶，即為AA基因型；若酶切后，產生159 bp、125 bp和26 bp 3條條帶，即為GG基因型；若酶切后，產生185 bp、159 bp、125 bp和26 bp 4條條帶，即為AG基因型。隨機從每種基因型PCR擴增產物中選取5個，進行核苷酸序列測定，其結果均與本實驗相同(圖1)。

圖1GSTZ1 Lys32Glu擴增后酶切結果

M.核酸分子標準；1、4、5.AG基因型；2.AA基因型；3.GG基因型(26 bp顯示欠清)

Figure 1GSTZ1 Lys32Glu enzyme digestion results after amplification

1.3統計學方法應用SPSS 19.0 統計軟件分析數據，組間基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1GSTZ1 Lys32Glu基因Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗經Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(χ2=0.169，P=0.919)，說明符合此定律，提示該樣本來自同一總體，具有代表性。

2.2伊朗、澳大利亞、德國、美國人群與河北漢族人群GSTZ1 Lys32Glu基因型和等位基因分布頻率的比較伊朗人群、澳大利亞人群、德國人群、美國人群與河北漢族人群GSTZ1 Lys32Glu基因型和等位基因分布頻率差異有統計學意義(P<0.05)。澳大利亞人群、德國人群、美國人群與伊朗人群差異有統計學意義(P<0.05)，而澳大利亞人群、德國人群、美國人群之間差異無統計學意義(P>0.05)。

在不同國家人群GSTZ1 Lys32Glu基因型頻率分布構成比中，河北漢族人群中AA基因型所占比例最高(23.33%)，明顯高于其他人群；GG基因型所占比例最低(24.77%)，明顯低于其他人群。在伊朗人群中，AA基因型所占比例最低(5.13%)，GG基因型所占比例是AA基因型的12.5倍(64.10%vs5.13%)。澳大利亞、德國和美國人群中AA基因型相對較少，AG和GG基因型所占比例基本相當。 在等位基因分布構成比中：河北漢族人群的A與G等位基因所占比例基本相等(49.29%vs50.71%)，而伊朗、澳大利亞、德國和美國人群G等位基因所占比率明顯高于A等位基因。見表1。

表1不同國家人群GSTZ1 Lys32Glu基因型分布的比較

Table 1　The comparisons of distributions of both genotype frequency and allele

*P<0.05與河北漢族人群比較#P<0.05與伊朗人群比較(χ2檢驗)

3討論

谷胱甘肽硫-轉移酶Zeta家族，是近來通過生物信息學方法和利用人類表達序列標簽數據庫發現的GST家族中的一種。存在于肝臟和其他組織的細胞質和線粒體基質中[10]。目前研究表明能夠編碼GST的基因分別分布在至少7 條不同染色體上，構成了一個超基因家族，編碼具有GST活性的蛋白。GSTZ1屬于其中一種，基因存在2種多態性，即DNA 序列94 和124 處的變化，從而分別導致Lys-32→ Glu 及Arg-42→Gly 的替代[4，9，11]。關于GSTZ1 Lys32Glu基因多態性與疾病易感性的研究國外已有許多報道，如Karaka-Celik 等[12]報道GSTZ1基因多態性和患胃癌的風險無關聯。Saadat 等[13]研究表明GSTZ1 Lys32Glu基因多態性與先兆子癇無關，而GSTZ1 Arg42Gly基因多態性等位基因變化可降低患先兆子癇的風險。Rezaei等[14]研究表明，在早發雙相情感障礙型患者中，Glu32Lys和G-1002A的變異等位基因會增加患病的易感性。本研究主要研究河北漢族人群GSTZ1 Lys32Glu基因多態性的分布，為以后與疾病相關性研究做準備。

本研究結果顯示GSTZ1 Lys32Glu的基因多態性在地域和人種中的分布明顯不同。河北漢族人群GSTZ1 Lys32Glu的基因存在多態性，符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，具有代表性。河北漢族人群GSTZ1 Lys32Glu基因型頻率分布和等位基因頻率分布與伊朗人群、澳大利亞人群、德國人群、美國人群明顯不同[14-17]。河北漢族人群中A等位基因占49.30%，明顯高于其他人群。Nafissi 等[18]研究發現中國人A等位基因占48.9%，本研究結果與其高度一致。我國人口眾多，多民族大聚集，基因多態性與民族及區域環境相關，所以其他省份和民族是否存在GSTZ1 Lys32Glu基因型頻率分布和等位基因頻率的差異，還需進一步研究。A等位基因在中國人中高表達，是否會造成其下游編碼蛋白的活性下降，增加患遺傳性酪氨酸血癥的風險，還需擴大樣本量和多中心研究證實。本研究發現河北人群與其他人群不同，考慮人種和地域不同所致。伊朗人群A等位基因占20.5%，明顯低于中國河北漢族人群和澳大利亞、德國和美國人群，伊朗地處歐亞、印度洋與阿拉伯三大板塊交界處，環境特殊；伊朗人與中國漢族人和歐美人群明顯不同，其GSTZ1 Lys32Glu基因的多態性，考慮可能與人種和環境有關，當然還需其他研究支持。本研究結果顯示，澳大利亞人群、德國人群、美國人群在GSTZ1 Lys32Glu基因型頻率分布和等位基因頻率分布差異無統計學意義。考慮三者人種相同，有相同遺傳背景，環境因素對基因多態性影響不大。本研究可以為人種起源提供一定依據。當然，GSTs屬一個超家族，其他亞基因型是否也存在類似的不同，還需更多研究證實。

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(本文編輯：許卓文)

Genetic polymorphism of glutathione S-transferase zeta1 among healthy Han population in Hebei province

FAN Zhi-liang1，2，FENG Xiao-juan3，LI Chun-yan2，

YIN Shao-hua1，TIAN Xin-ying2*，REN Wen-bo4

(1.Department of Neurology Ⅲ,the People′s Hospital of Xingtai City,Hebei Province,Xingtai

054001,China;2.Department of Neurology,the Second Hospital of Hebei Medical University，

Hebei Province,Shijiazhuang 050000,China;3.Department of Ultrasound,the People's

Hospital of Xingtai City,Hebei Province,Xingtai 054001,China;4.Department of

Neurology,the Fifth Central Hospital of Tianjin,Tianjin 300000,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the glutathione S-transferase zeta 1(GSTZ1)genetic polymorphisms among healthy Han population of Hebei province.MethodsUsing polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) to detect the genotypes of GSTZ1 Lys32Glu in 210 healthy Han population of Hebei province.ResultsThe genotype distribution of the healthy Hebei Han population is consistent with Hardy-Weinberg genetic equilibrium law.The distributions of both genotype frequency and allele frequency of GSTZ1 Lys32Glu in Hebei healthy Han population are significantly different from those in Iranian,Australian,German and American(P<0.05). The distributions of both genotype frequency and allele frequency of GSTZ1 Lys32Glu in Iranian are significantly different from those in Australian,German and American(P<0.05), however,there are no significant difference among Australian,German and American in the distributions of both genotype frequency and allele frequency of GSTZ1 Lys32Glu(P>0.05). ConclusionThe distributions of both genotype frequency and allele frequency of GSTZ1 Lys32Glu in Hebei healthy Han population own its characters.The distributions of GSTZ1 Lys32Glu in regions and races are significantly different.

[Key words]gene;polymorphism;glutathione S-transferase zeta 1;Hebei Han population

[中圖分類號]R394.3

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)02-0133-04

通訊作者*。E-mail：txyhb@126.com

[作者簡介]范志亮(1982-)，男，河北邢臺人，河北省邢臺市人

[基金項目]邢臺市科學技術研究與發展計劃(2013ZC171)

[收稿日期]2015-05-13；[修回日期]2015-06-04