基于IGS和Histone 基因的我國芒果鐮孢菌遺傳多樣性分析

吳丹妮, 趙志慧, 王艷紅, 周 揚, 姚毅恒, 陸 俊， 呂國忠

(大連民族大學環境與資源學院, 遼寧大連 116600)

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基于IGS和Histone 基因的我國芒果鐮孢菌遺傳多樣性分析

吳丹妮, 趙志慧*, 王艷紅, 周 揚, 姚毅恒, 陸 俊， 呂國忠

(大連民族大學環境與資源學院, 遼寧大連 116600)

摘要[目的]研究我國芒果鐮孢菌的遺傳多樣性。[方法]從云南、廣西、海南等芒果主產區芒果花序上分離得到芒果鐮孢菌，采用IGS、Histone 2個基因片段對芒果鐮孢菌進行遺傳多樣性分析。[結果]我國芒果鐮孢菌具有多個譜系，致病芒果鐮孢菌為單系群。[結論] 我國芒果鐮孢菌具有較高的遺傳多樣性。

關鍵詞芒果；花序畸形病；芒果鐮孢菌

Genetic Diversity ofFusariummangiferaein China Inferred from IGS and Histone

WU Dan-ni, ZHAO Zhi-hui*,WANG Yan-hong et al (College of Environmental and Resource Science, Dalian Nationalities University, Dalian, Liaoning 116600)

Abstract[Objective] To study genetic diversity ofFusariummangiferaein China. [Method] Genetic diversity amongF.mangiferaefrom Hainan, Guangxi and Yunnan provinces using the partial IGS and Histone gene sequences were analyzed. The strains were isolated from symptomatic and non-symptomatic inflorescences and twigs. [Result]It was indicated that high genetic variation existed among those strains in China, while the pathogenetic isolates were monophyletic. [Conclusion]Fusariummangiferaein China has high genetic diversity.

Key wordMango; Mango malformation;Fusariummangiferae

芒果花序畸形病(Mango malformation disease, MMD)已成為目前芒果生產上的主要病害之一[1]，在世界上主要芒果產區如菲律賓、馬來西亞、南美的墨西哥等一些國家均有發生[2-3]，并不斷蔓延。一旦發生芒果花序畸形病，芒果樹不能正常開花結果，造成巨大的經濟損失。

Watt等[4]于1891年首次發現芒果花序畸形病，通過柯赫氏法則證明該病是由鐮孢菌FusariummoniliformeSheldon var.subglutinansWollenweber & Reinking引起的[5]，根據形態學和分子系統學研究結果將該病原菌正式定名為芒果鐮孢菌F.mangiferaeBritz, Wingfield et Marasas[6]。到目前為止，已報道引起芒果花序畸形病的病原鐮孢菌除芒果鐮孢菌外，還有3種：F.mexicanumT. Aoki, S. Freeman, Otero-Colina, Rodríguez-Alvarado, Fernández-Pavía, Ploetz et O’Donnell，F.sterilihyphosumBritz, Marasas & Wingfield，F.pseudocircinatumO'Donnell & Nirenberg[7-8]。2008 年8 月在四川攀枝花和云南華坪首次發現了芒果畸形病[1]，經鑒定該病原菌為F.mangiferaeBritz, Wingfield et Marasas[9]。該病主要發生在我國金沙江干熱河谷地區且日趨嚴重，發病率可達30%～60%，有的甚至高達95%[10]。筆者對廣西、海南、云南等地芒果花序上的芒果鐮孢菌進行研究，采用IGS和Histone 2個基因片段分析芒果鐮孢菌的遺傳多樣性，從而研究芒果鐮孢菌在我國的發生分布情況。

1材料與方法

1.1材料供試30株鐮孢菌來自廣東省、海南省、廣西壯族自治區3省區開花期芒果花序(表1)。采用組織分離法在PDA培養基上分離培養菌株，采用單孢分離法獲得純培養，在SNA培養基上培養保存，保藏于大連民族大學真菌資源與利用實驗室。

表1　供試菌株及來源

1.2DNA提取及PCR擴增DNA提取方法參照Lee等[11]方法。IGS區采用擴增引物NL11、CNS1及中間引物NLa、CNSa進行PCR擴增并測序[12]，退火溫度58 ℃。Histone片段采用引物H3-1a和H3-1-b進行PCR擴增并測序[13]。PCR產物送上海生工生物工程有限公司測序。測序結果在NCBI中比對，并構建系統發育樹。

1.3系統發育分析用軟件ClustalX進行比對，手動調整。采用軟件MEGA6.0，以F.saccahari(NRRL13999)為外群，分別構建基于IGS和Histone的最小進化樹，Bootstrap 1000 replicates； seed=64238。

2結果與分析

2.1Histone基因片段分析采用引物H3-1a和H3-1b對來自芒果花序的30株鐮孢菌Histone H3區DNA進行PCR擴增，得到約447 bp的基因片段。以甘蔗鐮孢菌F.sacchari菌株NRRL13999為外群，采用MEGA 6.0構建最小進化樹(圖1)，對芒果花序畸形病菌進行分析。F.mangiferae形成3個譜系：I、II、III。譜系I包括菌株19、18、34、15、33、30、14、29、32、16、23、17、5(bootstrap=63%)；菌系II包括菌株1、9、10、11、12、8、6、7(bootstrap=66%)；菌系II包括3、4、13(bootstrap=96%)。在F.mangiferae中，菌系II的菌株均來自云南省華坪地區，菌系I的菌株則主要來自海南地區，菌系III中的3、4號菌株來自廣西百色，而13號菌株則來自海南三亞。

圖1　基于Histone H3基因片段構建芒果鐮孢菌的最小進化樹Fig. 1　 Minimum evolution tree of Fusarium mangiferae in China inferred from Histone H3 sequences data

2.2IGS片段分析采用鐮孢菌基因內間隔區IGS引物NL11和CNS1[12]，對來自我國芒果花序的30株鐮孢菌進行PCR擴增，得到約2 200 bp的基因片段。以甘蔗鐮孢菌F.sacchari菌株NRRL13999為外群，采用MEGA 6.0構建最小進化樹(圖2)。基于IGS區構建的最小進化樹與Histone H3構建的最小進化樹基本一致，結合Histone H3基因片段的最小進化樹，將全部F.mangiferae分為3個譜系：I、II、III。IGS片段最小進化樹中，譜系II依然形成一個單系群(bootstrap=100%)，而與來自廣西、海南的菌株分開(bootstrap =51%)。菌系I發生非常豐富的多樣性分化，其中包括來自海南和廣西的菌株。菌系III出現分化，13號菌株與菌系I親緣關系更近。

圖2　基于IGS基因片段構建我國芒果鐮孢菌的最小進化樹Fig. 2　Minimum evolution tree of Fusarium mangiferae in China inferred from IGS sequences data

3結論與討論

目前已報道的病原鐮孢菌有4種：F.mangiferae，F.mexicanum，F.sterilihyphosum以及F.pseudocircinatum[6-8,10]。我國發生的芒果花序畸形病主要由F.mangiferae引起[9]。鐮孢菌Histone H3是一個相對更為保守的區域，種內分歧較小，而IGS區域種內分歧較大，適于種內群體的研究。采用IGS和Histone H3 2種基因片段對采自云南、廣西、海南的芒果花序上分離的鐮孢菌進行遺傳多樣性分析。基于2個基因片段分別構建我國芒果鐮孢菌的最小進化樹，基于Histone H3的最小進化樹上所有芒果鐮孢菌形成3個譜系，而IGS最小進化樹上芒果鐮孢菌的種內分化明顯，形成更豐富的多樣性，表明在芒果鐮孢菌中Histone H3基因片段較IGS更為保守。為了便于分析，以Histone H3的最小進化樹為標準，將所有芒果鐮孢菌分為3個譜系：I、II、III。所有來自我國芒果花序畸形病重災區云南省華坪縣的菌株均在譜系II中，無論在Histone H3還是IGS系統分析中均未發生遺傳分化，說明來自華坪的致病性芒果鐮孢菌遺傳信息較為單一，可能是單一來源的，即發生在華坪縣的芒果花序畸形病可能是從一個地區一批次傳播到該地區的。譜系I在我國海南地區普遍存在，且遺傳分化明顯，具有豐富的遺傳多樣性。譜系III菌株主要來自廣西和海南，但用于研究的菌株較少，未見明顯的遺傳分化和多樣性。譜系I和譜系III菌株主要分布在廣西和海南，但未見明顯的芒果花序畸形病的癥狀。

該研究發現我國芒果鐮孢菌遺傳多樣性非常豐富，分化程度極高，這可能與芒果的東南亞起源以及在我國具有悠久的種植歷史有關，芒果鐮孢菌在與芒果的長期共存中發生遺傳分化。

參考文獻

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收稿日期2015-12-04

作者簡介吳丹妮(1994- )，女，黑龍江虎林人，本科生，專業：生物技術。 *通訊作者，講師，博士，從事真菌分類學研究。

基金項目中央高校基本科研業務費專項基金項目(DC201502070301); 大學生創新創業訓練計劃項目(S2014055)。

中圖分類號S 188+.1

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)01-234-02