家蠶生物反應器共表達豬α+γ干擾素的生產研究

丁 農， 張金衛， 李江濤， 魚南洋， 馮世民， 沈建華， 徐森華

(湖州市農業科學研究院，浙江湖州 313000)

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家蠶生物反應器共表達豬α+γ干擾素的生產研究

丁 農， 張金衛， 李江濤， 魚南洋， 馮世民， 沈建華， 徐森華

(湖州市農業科學研究院，浙江湖州 313000)

近年來，隨著基因工程技術的發展，家蠶生物反應器(家蠶BmNPV桿狀病毒表達載體系統)生產轉基因生物活性物質的良好特性被生物學家所認識，許多基因工程產品通過家蠶這一優良生物反應器得到表達，家蠶生物反應器成為免疫學和基因工程真核生物表達系統等研究領域的重大進展之一[1]。采用家蠶生物反應器技術成功地表達了乙肝表面抗原的M蛋白基因[2]、丙肝病毒核心蛋白[3]、類胰島素樣生長因子-1[4]、禽馬立克氏病毒糖蛋白B抗原[5]、口蹄疫疫苗抗原[6-7]等產品，其中有的已經產業化，具有廣闊的應用前景和巨大的社會經濟效益。

干擾素(Interferon,IFN)是人和動物細胞受到特定干擾素誘生劑刺激后，由巨噬細胞、淋巴細胞等產生的一種具有多種生物學活性的糖蛋白。干擾素具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫增強等多種生物活性，具備無休藥期、無藥殘、無毒副作用、不產生耐藥性、可反復使用的優點，為目前最理想的一種抗病毒生物制劑。干擾素IFN-α和干擾素IFN-γ聯合使用具有協同作用，比單獨使用其中一種具有更強的抗病毒效果[8-9]。因此，利用基因工程技術制備含有豬干擾素α和豬干擾素γ的復合型干擾素對防治豬的病毒性疾病具有重要意義。

中國農業科學院生物技術研究所成功研究出豬的α干擾素基因和γ干擾素基因重組家蠶桿狀病毒共表達載體rBmNPV(BmIFN-α+γ)，并取得了發明專利，可以將豬α干擾素基因和γ干擾素基因在家蠶桿狀病毒生物反應器中聯合表達或共表達，所表達的重組α干擾素產物和重組γ干擾素之間具有協同增效作用，能夠提高重組干擾素產物的效價及穩定性[10-11]。筆者采用該共表達載體，研究以家蠶為生物反應器規模化共表達豬α+γ干擾素的生產應用中存在的相關技術問題，以期為家蠶生物反應器規模化共表達豬α+γ干擾素生產提供技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料 rBmNPV(BmIFN-α+γ)重組病毒培養液由中國農業科學院生物技術研究所提供，在4 ℃條件下保存備用。α干擾素ELISA檢測試劑盒由德國IBL公司生產，上海將來實業有限公司提供；試驗用蠶品種由湖州市農業科學研究院保存飼養，規模化生產試驗用蠶繭由安吉縣良棚鎮黃金村和南潯區菱湖鎮射中村分別生產提供，酶標儀和10萬級無菌凈化車間等儀器設備由湖州市農業科學研究院提供。

1.2試驗方法

1.2.1共表達干擾素重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)的接種注射。蠶蛹接種注射前剔除壞死、敗血和蠅蛆等不健康蠶蛹，然后用0.3%的次氯酸鈣進行蛹體浸漬消毒涼干；rBmNPV(BmIFN-α+γ)重組病毒按105pfu /頭(5 μl/頭)接種蠶蛹，置于25～26 ℃下表達4.5 d，收集發病蠶蛹，于-20 ℃冷凍保存供檢測。

1.2.2共表達干擾素重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)表達量的檢測。采用α干擾素ELISA檢測試劑盒，以IFN-α表達量來說明IFN-α+γ的表達量。按雌雄1∶1的比例隨機抽取20頭蠶蛹，勻漿機研磨蛹體，離心取上清液，按照試劑盒說明書進行表達量檢測。其原理：應用雙抗體夾心法測定樣本中豬IFN-α的水平。用純化的豬IFN-α抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入IFN-α，再與HRP標記的IFN-α抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IFN-α呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中豬IFN-α含量。

1.2.3共表達干擾素(BmIFN-α+γ)規模化生產用蠶品種的選擇。選擇湖州市農村推廣應用的春用多絲量品種菁松×皓月(正反交)和夏秋用中絲量秋豐×白玉(正反交)進行豬rBmNPV(BmIFN-α+γ)表達量的測試，以選擇規模化應用的農村推廣品種，采用表達量高的品種作為規模化生產應用品種。

1.2.4手工接種與機械接種對干擾素重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)表達效率的影響。采用湖洲市農業科學研究院生產的專利產品蠶蛹集團注射機器[12]注射與手工注射進行工作效率與產品表達效率的比較，以了解采用機械注射生產的可行性和優勢。供試品種為皓月×菁松，注射劑量相同為105pfu /頭(5 μL/頭)，機器按4人標準配制，其中3人放蛹，1人操作機器注射，對照為4人進行手工注射蠶蛹，工作時間定為7.0 h(上午、下午各3.5 h)。

1.2.5蠶蛹注射接種干擾素重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)適期的確定。采用皓月×菁松蠶品種從熟蠶上蔟開始于25 ℃保護，在上蔟的第4天起即化蛹的第1～10天每天連續接種注射200頭健康蛹，注射接種后的蠶蛹于25 ℃保護7 d，調查注射蠶蛹的細菌敗血病死亡率、化蛾率(有變態形狀不能羽化死亡的也計入化蛾頭數)及接種成功率。

1.2.6蠶蛹的冷藏對重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)表達量的影響。將供試蠶兒上蔟結繭后于25 ℃保護6 d為冷藏起始日，分別于冷柜(4～5 ℃)冷藏5、10和15 d時將蠶繭削繭取蛹，然后手工注射干擾素重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)，檢測表達效率，以未經冷藏的蠶蛹接種作為對照。

2結果與分析

2.1共表達干擾素(BmIFN-α+γ)規模化生產用蠶品種檢測結果表明，菁松×皓月、皓月×菁松、秋豐×白玉、白玉×秋豐的IFN表達量為710.61、805.69、577.49和592.12 ng/L。由此可知，品種間對重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)的表達效率差異較大，春用品種以皓月×菁松為好，夏秋用品種以白玉×秋豐為好。

2.2手工接種與機械接種對干擾素重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)表達效率的影響對采用該設備的生產效率及產品表達量與手工注射生產方式進行了比較。由表1可知，機器注射共接種蠶蛹16 744顆/(d·人)，手工注射共接種蠶蛹4 102顆/(d·人)，機械注射接種效率提高了3倍以上，檢測產品表達量相差不大，說明在保準產品質量的前提下，機械注射接種可以大幅度提高工作效率。

表1手工接種與機械注射對生產效率及豬干擾素基因(BmIFN-α+γ)表達量的影響

Table 1Expression comparison of production efficiency and porcine interferon gene (BmIFN-α+γ)

注射接種方式Injectionmethod注射蠶蛹頭數Numberofinjectedsilkwormchrysalis顆/(d·人)工效指數EfficiencyindexIFN表達量IFNexpressionng/L手工注射接種Manualinjection4102100826.09機械注射接種Mechanicalinjection16744408823.24

2.3重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)的蠶蛹注射適期由表2可知，過早注射因蠶蛹太嫩容易出血，增加細菌感染機會，造成損失，接種成功率低，而過遲注射蛹體內容物已形成各種器官，不利于重組桿狀病毒的繁殖，化蛾率大幅度提高，接種成功率低。從調查結果看，在蠶上蔟后25 ℃保護，第5～9天是注射適期，以第6～8天為最佳，蠶品種不同或蠶繭保護溫度不同在注射適期上會略有差異。

表2　重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)的注射適期

2.4蠶蛹的冷藏對重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)表達量的影響由圖1可知，將蠶繭冷藏于4～5 ℃,冷藏5與10 d的表達量與未經冷藏處理蠶蛹的表達效率差異不大，而冷藏15 d的表達量顯著下降。因此在規模化生產時如遇到蠶蛹接種注射速度與勞動力緊張的突出矛盾時，可以將蠶繭冷藏于4～5 ℃ 10 d以內，對重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)在蠶蛹中的表達效率影響不大，在規模化生產中可以利用冷藏來延長蠶蛹接種適期。

圖1　不同時間冷藏蠶蛹的重組桿狀病毒rBmNPV(IFN-α+γ)表達量Fig. 1　Expression quantity of recombinant baculovirus rBmNPV(IFN-α+γ) in silkworm chrysalis under different cold storage days

3小結與討論

該試驗采用中國農業科學院生物技術研究所研究成果豬的α干擾素基因和γ干擾素基因重組家蠶桿狀病毒共表達載體rBmNPV(BmIFN-α+γ)，研究利用家蠶(蠶蛹)生物反應器進行規模化生產的相關技術。結果表明，蠶品種對豬干擾素基因(IFN-α+γ)的表達效率差異較大，皓月×菁松的表達效率高于其他品種，因此選擇高表達效率的蠶品種是提高生產效率的有效手段。注射接種是一項勞動力密集型的工作，且技術要求高，該試驗采用機器注射平均每天人均注射接種量比手工注射提高了3倍以上，且對產品表達量無影響，該機械把注射器的消毒、清洗、加藥、蠶蛹接種等步驟在機械上逐一完成，標準容易制定和控制，有利于規模化和標準化生產，提高工作效率和降低生產成本。從該試驗結果看注射接種的最佳時間以蠶上蔟的第6～8天為最佳，最佳注射時間的短促為規模化生產帶來很大不便，通過冷藏蠶蛹的生產試驗顯示在4～5 ℃冷藏10 d對重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)在蠶蛹中的表達效率影響不大，因此在規模化生產上可以通過冷藏蠶繭的方式來延長蠶蛹接種適期。2015年春秋蠶期，采用上述的試驗結果成功進行了生產1 t鮮繭規模的共表達基因工程產品豬α+γ干擾素的試生產，春用品種采用皓月×菁松，夏秋用品種采用白玉×秋豐，生產得率為55%～60%，即1 t鮮繭可生產豬α+γ干擾素共表達蠶蛹0.55～0.60 t。實踐證明只要在生產上將適合不同季節飼養的蠶品種合理運用，蠶期養蠶收蟻時間作合理的安排以及結合機械的使用和規范操作可以確保規模化生產的成功。

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摘要[目的] 研究家蠶生物反應器規模化共表達基因工程產品豬α+γ干擾素的關鍵技術，為家蠶生物反應器規模化共表達豬α+γ干擾素的生產提供技術支持。[方法]采用α干擾素ELISA檢測試劑盒檢測蠶品種、接種方式、蠶蛹冷藏對共表達干擾素重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)表達量的影響。 [結果]不同蠶品種對重組桿狀病毒的表達效率差異較大，春用品種選擇皓月×菁松，夏秋用品種選擇白玉×秋豐。機械注射接種效率比手工注射提高了3倍以上，檢測產品表達量相差不大。蠶在上蔟后25 ℃保護，第5～9天是注射適期，以第6～8天為最佳。蠶繭冷藏于4～5 ℃ 10 d以內，對重組桿狀病毒在蠶蛹中的表達效率影響不大。[結論]采用高表達效率的蠶品種以及結合機械的使用和規范操作可以確保規模化生產的成功。

關鍵詞家蠶生物反應器；共表達；豬；α+γ干擾素

Productive Study of Silkworm Bioreactor Porcine Co-expression α+γ Interferon

DING Nong, ZHANG Jin-wei, LI Jiang-tao et al (Huzhou Academy of Agricultural Sciences, Huzhou, Zhejiang 313000)

Abstract[Objective] To study the key technologies of silkworm bioreactor large scale porcine co-expression α+γ interferon, and provide technical support for the production of silkworm bioreactor large scale porcine co-expression α+γ interferon. [Method]α interferon ELISA testing kits were used for testing the effects of silkworm varieties, inoculation methods and silkworm pupae cold storage on the amount of expression of co-expression interferon recombinant baculovirus rBmNPV (BmIFN-α+γ). [Result] Different kinds of silkworms differ largely in expression efficiency to recombinant baculovirus, with Haoyue × Jingsong higher and Qiufeng × Baiyu lower. Mechanical injection inoculation was over three times more efficient than manual, with similar expression of tested products. After mounting, the silkworms needed to be protected at a temperature of 25 ℃. The fifth to ninety day was the optimum time for injection, with the sixth to eighth the best. Cocoons were refrigerated at 4-5 ℃ for ten days, which had a little influence on the expression efficiency of recombinant baculovirus in cocoons.[Conclusion] The use of high expression efficiency silkworm varieties and the standardized use of machines can ensure the success of large scale production.

Key wordsSilkworm bioreactor；Co-expression；Porcine；α+γ Interferon

收稿日期2015-12-07

作者簡介丁農(1961- )，男，浙江德清人，研究員，從事家蠶遺傳育種及生物技術應用研究。

基金項目浙江省公益技術農業項目(2014C32054)；湖州市公益技術應用研究項目(2013GY09)。

中圖分類號S 882.3+1

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)01-220-03