玉蟬花花粉生活力檢測和超低溫保存研究

姜忠國，董 丹，張 琪，李晨然，范麗娟，陳恒利，彭宏梅，王 玲*

(1.東北林業大學園林學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北林業大學帽兒山實驗林場，黑龍江哈爾濱 150611)

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玉蟬花花粉生活力檢測和超低溫保存研究

姜忠國1，董 丹1，張 琪1，李晨然1，范麗娟1，陳恒利2，彭宏梅2，王 玲1*

(1.東北林業大學園林學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北林業大學帽兒山實驗林場，黑龍江哈爾濱 150611)

超低溫保存技術目前被認為是保存植物材料最有效、最理想的方法，在液氮環境下，植物材料所有的生命代謝活動幾乎完全停止[1-2]，可以實現永久、安全、無污染地保存植物材料的優質遺傳基因；可以保持組織培養植物形態發生的能力，利于植物種質永續利用和便于不同地區間的種質交換；并且超低溫保存具有在使用設備上和保存過程操作上都比較簡單的優勢。花粉的超低溫保存，也是植物種質資源保存的一種方式，可以有效地延長花粉壽命，在應用時不受花期的限制。目前花粉的超低溫保存研究很多，主要集中在李樹[3]、馬鈴薯[4]、甘藍型油菜[5]、小麥[6]等果樹和農作物上，并取得顯著保存效果。觀賞植物芍藥、玉蘭、梅花[7]等的花粉超低溫保存也比較成功，但草本花卉報道較少。鳶尾屬植物是觀賞價值較高的觀花植物，國內外都比較注重特殊花型和花色新品種的培育，培育方法仍以雜交育種為主，花粉的有效儲藏對解決雜交育種親本花期不遇問題具有重要意義[8-9]。近年來鳶尾屬植物研究還涉及花粉單倍體育種、花粉遺傳特性等，對花粉需求越來越多，但花期限制的問題也日益凸顯，因此開展鳶尾屬植物花粉超低溫保存技術研究非常必要。

玉蟬花(IrisensataThunb.)是鳶尾屬中夏花的耐寒種，主要分布在我國東北地區及俄羅斯等地。其株型特別，葉片青翠似劍，花為深藍紫色，花朵碩大，適合布置水生鳶尾專類園或在池旁、湖畔點綴，它不僅是園林綠化和濕地修復的優良觀花觀葉種類，在切花應用上也是極好的材料[10-13]。筆者以玉蟬花花粉為材料進行超低溫保存研究，研究結果既可以有效地保護玉蟬花種質資源又可為鳶尾屬植物耐寒雜交育種提供充足的花粉，同時為鳶尾屬植物其他種質花粉超低溫貯存研究和種質資源保存研究提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料玉蟬花花粉于2014年6月中旬采自東北林業大學帽兒山試驗基地。

1.2試驗方法

1.2.1花粉采集。選擇天氣晴朗早晨采集玉蟬花花蕾，將其放入硫酸紙袋后帶回實驗室，然后將花藥從花蕾中取出后放在硫酸紙上，用解剖針將花粉從花藥上剝離后放在硫酸紙上，每一處理采集10個植株上的花粉，均勻混合后進行試驗。

1.2.2花粉活力測定方法。采用懸滴法進行花粉活力檢測。最適培養基的篩選采用2因素即蔗糖(100、150和200 g/L)與H3BO3(100、200 mg/L)組合試驗。上述培養基均添加CaCl2150 mg/L、Fe2(SO4)350 mg/L、KNO350 mg/L和MgSO4·7H2O 100 mg/L，混合均勻后放在4 ℃冰箱中保存、備用。用移液槍在單凹片的載玻片凹陷處滴加20 μL培養液，再用解剖針蘸取玉蟬花花粉均勻撒在培養液上，不要堆積。蓋上蓋玻片，再用培養液在蓋玻片周圍封片。將做好的玻片放在有濕潤濾紙的培養皿內，以保持載玻片濕潤，在溫度為(25±2)℃的黑暗培養箱中進行花粉萌發培養，培養時間2 h。花粉萌發的標準是以花粉管長度超過花粉直徑的2倍為宜。每個處理重復3次，每個重復隨機選取4個視野統計萌發率。

花粉萌發率=某視野萌發花粉數/該視野統計花粉總數×100%

1.2.3花粉含水量測定。采用烘干法。將烘箱的溫度調至(105±2)℃，測得安瓿瓶重量(a)；然后加入0.4 g左右新鮮花粉，再稱安瓿瓶和花粉的重量(b)；放入烘箱內，打開安瓿瓶蓋，在溫度(105±2)℃下烘干2 h后封口取出，放入干燥器內，冷卻20～30 min，取出稱重(c)。

花粉的含水量設為d，即d=[(b-c)/(b-a)]×100%

式中，a為安瓿瓶重量(g)，b為安瓿瓶及測定樣品烘干前的重量(g)，c為安瓿瓶及測定樣品烘干后的重量(g)。

1.2.4花粉的脫水處理。采用白熾燈照射脫水法降低花粉的含水量，用普通型的220 V、60 W可調節臺式白熾燈，調節燈泡至花粉的距離為15 cm處開燈加熱，烘干脫水。每1 h測量一次含水量。

1.2.5玉蟬花花粉的超低溫保存及解凍方法。將經過適度干燥的玉蟬花花粉用錫箔紙包好后放入1.8 ml凍存管中，花粉的量不能超過凍存管容積的2/3，之后將瓶蓋擰緊，標記好的凍存管放在凍存管架上投入液氮(-196 ℃)中。在液氮中凍存24 h后，將凍存管從液氮中取出，采用不同的化凍方法解凍：室溫化凍約30 min，為慢速化凍；40 ℃水浴化凍5～6 min，為快速化凍；自來水水沖化凍6～7 min，為室溫化凍。之后即可進行保存后的花粉活力檢測。對保存效果好的花粉在保存1年后再次進行活力檢測。

1.3數據分析采用SPSS17.0和Excel軟件對所測數據進行統計分析，用Duncan法對各測定數據進行多重比較。

2結果與分析

2.1花粉離體萌發培養基的篩選由表1可知，玉蟬花的花粉離體萌發培養不僅與蔗糖濃度有關，也受硼酸濃度的影響，當硼酸濃度一致時，玉蟬花花粉萌發率隨著蔗糖濃度的增加呈先升高后稍有所下降的趨勢，但下降差異不顯著(P<0.05)。這說明當蔗糖濃度達到花粉萌發所需要的濃度后過多的蔗糖不會促進花粉萌發，但也不會抑制花粉萌發。硼酸對玉蟬花花粉萌發的影響趨勢與蔗糖相同。當蔗糖濃度為 150 g/L，硼酸濃度為200 mg/L時，花粉萌發2 h時花粉萌發率最高達到(55.86±3.73)%，由此可知，玉蟬花花粉離體萌發適宜的培養基配方為蔗糖150 g/L+H3BO3200 mg/L+CaCl2150 mg/L+Fe2(SO4)350 mg/L+KNO350 mg/L+MgSO4·7H2O 100 mg/L。

2.2不同花期玉蟬花花粉萌發率比較由表2可知，采用萌發法測得的花粉活力為初花期和盛花期較高，從透色期到末花期花粉活力呈先升高后降低的趨勢，在初花期花粉活力達到最高，為(57.65±7.24)%，但與盛花期花粉活力(51.87±3.06)%差異不顯著。盛花期花粉活力雖較高，但此時期花藥開裂，花粉極容易在采集過程中散去，所以采用初花期花粉作為保存材料在取樣時更方便。在花粉活力檢測方法中，通常認為花粉萌發法更能直觀、有效地證明花粉萌發能力，所以后期花粉保存后活力檢測都采用萌發法。

表1不同處理下玉蟬花花粉的萌發率

Table 1Screening of the germination medium in vitro ofIrisensatapollen

處理Treatment蔗糖Sucrose∥g/L硼酸Boricacid∥mg/L萌發率Germinationrate∥%①10010022.48±1.11c②10020032.35±3.29b③15010050.77±3.96a④15020055.86±3.73a⑤20010050.07±0.02a⑥20020054.66±3.06a

注：表中數據為平均值±SD；同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

Note：Date in the table were mean ± SD．Different lowercases in the same column indicated significant differences at 0.05 level(P<0.05), the same as follows.

表2不同花期玉蟬花花粉活力比較

Table 2Comparison of the pollen viability ofI.ensatain flowering stage

處理Treatment花期Floweringstage萌發率Germinationrate∥%①透色期7.27±0.36c②綻口期22.15±4.31b③初花期57.65±7.24a④盛花期51.87±3.06a⑤末花期24.99±3.42b

注：表中數據為平均值±SD(n=12)；同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

Note：Date in the table were mean ± SD(n=12).Different lowercases in the same row indicated significant differences at 0.05 level(P<0.05).

2.3不同含水量玉蟬花花粉在超低溫保存后不同化凍方法下萌發率比較采集玉蟬花初花期花粉，采用白熾燈照射脫水法獲得不同含水量花粉。測得初始含水量為27.5%，經過1 h的白熾燈烘干干燥獲得含水量為20.0%的花粉，經過2 h左右的干燥獲得含水量為15.0%的花粉，再經過3 h左右的干燥獲得含水量為10.0%的花粉。對獲得的不同含水量花粉進行超低溫保存及不同化凍方法的研究。

由表3可知，玉蟬花花粉超低溫保存的成功與含水量和超低溫保存后的化凍方式有關。新鮮花粉(CK)的初始含水量為27.5%，保存前萌發率為(56.04±6.65)%，但超低溫保存后萌發率有所下降，且差異顯著(P<0.05)，效果較好的水浴化凍花粉萌發率降為(49.66±5.90)%；通過干燥法降低含水量后的花粉相對新鮮花粉萌發率雖有所降低，但超低溫保存后花粉萌發率卻有所升高，而且水浴化凍或自來水化凍花粉萌發率都高于室溫化凍，且差異顯著，由此可知，玉蟬花花粉超低溫保存后不適合緩慢化凍。當玉蟬花花粉含水量降至20.0%時，超低溫保存后水浴化凍和自來水化凍萌發率分別為(58.35±4.32)%、(60.53±6.12)%，且差異不顯著；當含水量降至15.0%時水浴化凍萌發率最高，為(58.86±2.76)%，與自來水化凍萌發率差異不顯著；當含水量降至10.0%時自來水化凍萌發率最高，為(52.55±2.73)%，與水浴化凍萌發率差異不顯著；且花粉含水量降至20.0%、15.0%時超低溫保存后在水浴化凍和自來水化凍方式下的萌發率高于新鮮花粉保存前的萌發率(56.04±6.65)%及其他處理，且差異顯著。將含水量20.0%的花粉保存1年后用自來水水沖化凍，萌發率為59.58%，與保存24 h后的檢測結果接近，差異不顯著。

表3　玉蟬花花粉超低溫保存后不同化凍方法下萌發率比較

注：表中數據為平均值±SD(n=12)；同列不同大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05 )。

Note：Data in the table indicated mean ±SD(n=12)．Different capital letters indicated extremely significant difference(P<0.01).Different lowercases letters indicated significant difference(P<0.05).

由此可知，玉蟬花花粉超低溫保存適合含水量為15.0%～20.0%，化凍方式選用水浴化凍和自來水化凍方式均可。但在試驗過程中水浴化凍方式凍存管有暴破現象，為了安全考慮，建議采用自來水化凍方式。相比較而言，自來水化凍方式不僅花粉萌發率高，與水浴化凍方式相比更加安全、方便、易于操作。通常認為植物超低溫保存過程中對植物的傷害主要在冷凍和解凍這2個過程，所以要提高花粉超低溫保存的成功率，選擇比較適宜的化凍方法同樣非常重要。

2.4玉蟬花花粉和花藥超低溫保存效果比較 因為花藥取材及運輸比較方便，將初花期的花藥直接進行超低溫保存，進一步檢測其保存效果。采用的化凍方式是自來水水沖，花藥超低溫保存前花粉活力為57.65%，保存后花粉活力為54.11%，雖然花藥超低溫保存后萌發率有所下降，但與花粉直接保存后的花粉活力差異不顯著。這表明玉蟬花花藥也可以作為超低溫保存材料實現花粉的保存。

3討論

3.1花粉超低溫保存適宜的采集時期植物花粉的質量、產量和散粉特點往往受環境及遺傳特性等因素的限制，所以不同物種花粉超低溫保存適宜的采集時期有明顯差別。Dantonio等[14]認為芹菜花粉在一天中不同時間采集其活力不受影響；Marchant等[15]對未開、半開、全開3種狀態月季品種的花粉活力進行研究，結果表明，全開或者未開的花朵花粉活力高，尤其是取未開的花朵可以減少花粉交叉污染的風險；梁立等[16]對比了紫菜苔幼嫩花粉、近成熟花粉和成熟花粉3個發育時期認為，成熟花粉的保存效果與近成熟的花粉相似，幼嫩花粉較差；而Craddock等[17]認為山茱萸剛開裂的花藥作為保存花粉效果較好；陶清波[18]研究認為牡丹花枝室內瓶插水養獲取花粉與室外栽培植株新鮮花粉無差異；該研究的玉蟬花，其花粉最佳采集時期為初花期，這一時期花粉活力較高且花藥還沒有開裂花粉采集容易且不會被污染。

3.2花粉超低溫保存活力檢測時間和適宜的含水量花粉超低溫冷凍活力檢測通常是在花粉凍存一段時間后進行，研究發現，甘藍型油菜花粉在液氮中貯藏30、60、90、120 d，貯藏時間對花粉活力大小的影響不顯著[5]；馬鈴薯花粉的超低溫保存只是保存前含水量對貯藏后花粉的活力有影響，液氮中的貯藏時間對貯藏后花粉的活力無顯著影響[19]；石思信等[20]研究發現‘延安黑麥’花粉在-196 ℃的低溫下保存360和362 d后，花粉活力仍保持在較高水平，而且在大田條件下用它們授粉獲得較高的結實率。而山龍眼屬花粉超低溫保存后某些種在保存270 d時萌發率明顯升高[21]，臘梅屬3個品種的花粉超低溫保存1年時，萌發率也比保存前高[22]。該研究也發現類似現象，玉蟬花適宜含水量的花粉在液氮中保存24 h和1年的萌發率差異不大。這主要是因為超低溫保存在液氮環境下的植物材料其所有的生命代謝活動幾乎完全停止，因而貯藏時間對花粉活力的影響不大，通常認為液氮中保存可以作為永久保存條件。花粉超低溫冷凍24 h已足以使花粉凍凝，此時期檢測的活力可以代表在液氮中的保存效果。但針對不同物種花粉在液氮中保存的最長期限問題還有待繼續跟蹤檢測，保存后活力升高的原因還有待繼續深入研究。

目前研究認為適宜的花粉含水量是實現超低溫保存的關鍵。花粉含水量越高，在進行超低溫冷凍過程中，細胞內的水分越容易形成冰晶，導致細胞膜受損，致使保存后的花粉死亡率升高，所以達不到超低溫保存的目的。新采集的花粉往往含水量較高，花粉潮濕結塊，在液氮保存時，花粉容易結成冰晶，活力喪失，不宜進行貯藏。脫水環節對花粉的超低溫保存至關重要，不同植物種類進行花粉超低溫保存的適宜含水量不同。如英國山核桃的最適含水量為7.5%以下[23]；廣杏的最適含水量為13.2%～20.8%[24]；大接杏為9.7%～14.6%[24]；張亞利等[7]對梅花花粉的超低溫保存結果表明，部分梅花品種花粉含水量高達40%時仍可實現超低溫保存；而對于某些材料如番茄[25]、魔芋[26]不經過干燥脫水即可直接投入液氮保存；該研究認為，玉蟬花花粉超低溫保存的最適含水量為15.0%～20.0%。可見不同植物種類花粉超低溫保存的適宜含水量因種而異。降低花粉含水量的方法很多，主要有室溫條件下自然脫水、白熾燈照射脫水、將花粉置于干燥的培養皿中用電吹風吹熱脫水，該研究采用白熾燈照射脫水，溫度掌控不好也會影響花粉活力，今后可嘗試其他脫水方法。

3.3花粉超低溫保存后適宜的化凍方式 花粉超低溫保存后在應用時要采用不同的化凍方法化凍，花粉超低溫保存后的化凍方式一般有室溫化凍、水浴化凍和自來水化凍等。研究認為，液氮保存對植物傷害發生在冰凍和化凍2個過程，因此要使植物種質的超低溫保存獲得成功，選擇合適的化凍方法非常重要，從而避免在化凍過程中產生細胞內的次生結冰，并防止在化凍吸水過程中水的滲透沖擊對細胞膜體系的破壞。超低溫保存材料在化凍時，有再次結冰的危險，這個危險溫度范圍是-5～10 ℃，因此化凍通常在溫水浴中進行，借助迅速的化凍方式通過此溫度區，避免細胞內次生結冰對細胞的致死性破壞。趙樹任等[27]研究認為番茄花粉超低溫保存后用自來水沖洗是較為理想的化凍方式；Towill[28]在50 ℃水浴中化凍10 s實現了茄屬花粉超低溫保存；陶清波[18]認為30 ℃的溫水對牡丹花粉超低溫保存后的化凍效果最佳；而張亞利等[7]認為梅花花粉采用自來水化凍及溫水浴化凍效果較好且兩者差異不明顯。該研究化凍方式選用水浴化凍和自來水化凍均可，差異不大，但在試驗過程中水浴化凍凍存管有暴破現象，建議采用自來水化凍。綜上所述，花粉超低溫保存后化凍方法的選擇應根據植物種類及其含水量的不同而有所差異。

植物材料超低溫保存效果的影響因素很多。植物的超低溫保存是一個非常復雜的過程，對于不同植物以及同一植物不同的材料類型，其超低溫保存的難易程度和效果都不同。因此，在進行植物材料保存時，首先要根據植物材料本身的特性，同時對影響保存效果的因素進行研究，并依據前人對這方面的研究經驗，篩選能夠提高植物材料超低溫保存的成活率和再生率的方法和途徑，達到對種質資源成功保存的目的。

該試驗中花粉超低溫保存只采用脫水處理即可實現超低溫保存，而無需使用冰凍保護劑，張亞利等[29]在花粉超低溫保存研究進展中也指出在花粉超低溫保存中，大部分植物材料無需使用冰凍保護劑，同時還提到在花粉超低溫保存中，一般不需要經過程序性降溫即可實現超低溫保存，因而，程序性降溫在花粉超低溫保存中應用較少。所以，該試驗中沒有對玉蟬花花粉進行程序性降溫處理，而是直接投入液氮。這些都為花粉在超低溫保存方面的后續研究提供了很大方便，節省了大量時間、人力、物力和財力。

4結論與建議

4.1結論玉蟬花花粉離體萌發較為適合的培養基配方：蔗糖150 g/L+H3BO3200 mg/L+CaCl2150 mg/L+Fe2(SO4)350 mg/L+KNO350 mg/L+MgSO4·7H2O 100 mg/L。可以采集玉蟬花初花期花粉進行超低溫保存，最適含水量為15.0%～20.0%，化凍方式選用自來水水沖化凍，此時的花粉萌發率由新鮮時的56.04%提高到保存后的60.53%。玉蟬花花藥也可以實現超低溫保存，但花藥超低溫保存后與保存前對照相比花粉萌發率有所下降，保存后花粉萌發率為54.11%。保存后的花粉活力符合花粉使用生活力要求。

花粉超低溫保存流程：首先是采集初花期的花粉(含水量約為27.5%)，將花粉從花藥中剝離，剝取足量的花粉放在硫酸紙折疊成的小盒中，置于白熾燈下，保持15 cm左右的距離進行花粉超干處理，1 h左右使花粉含水量降到15.0%～20.0%，將干燥處理后的花粉用硫酸紙包裹起來后放在凍存管中置于凍存管架上，投入液氮中保存，使用時采用自來水水沖化凍方式。

花藥超低溫保存流程：采集初花期的花藥，將其直接放入凍存管中，將凍存管放在凍存管架上，然后投入液氮中進行保存，在使用時采用的化凍方式是自來水水沖化凍。

4.2建議花粉萌發培養基的主要成分是各種不同類型的糖。其中，蔗糖被認為是形成花粉管最主要的能量來源。硼酸同樣被認為具有促進花粉萌發和花粉管生長的作用。除蔗糖和硼酸外，花粉管的伸長還需要依靠Ca2+來作為細胞壁擴張的主要成分并維持細胞質頂端的離子梯度。而該試驗僅進行了蔗糖和硼酸對玉蟬花花粉萌發的影響試驗，所以，建議以后進一步研究Ca2+以及其他元素對玉蟬花花粉萌發的影響；建議以后對超低溫保存后的玉蟬花花粉與保存之前授粉情況進行比較，進一步探討其保存效果，并對玉蟬花花粉的超低溫保存成功的機理進行研究；建議以后進行玉蟬花花粉重復保存效果的試驗。

對花粉的超低溫保存研究僅有幾十年的歷史，我國采用花粉超低溫保存技術開展研究的植物品種只有200多種，研究的主要對象是園藝植物和農作物，所以觀賞植物花粉種質資源超低溫保存庫的建立也將是今后的研究趨勢。

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摘要[目的] 研究花粉超低溫保存方法，對于解決植物雜交育種花期不遇問題以及實現種質資源的保存等都具有重要的現實意義。[方法]以鳶尾屬植物觀賞價值很高的耐寒種玉蟬花為研究對象，對其花粉懸滴法活力檢測離體培養基篩選和超低溫保存方法進行研究。[結果]玉蟬花花粉活力檢測較適合的液體萌發培養基配方為蔗糖150 g/L+H3BO3200 mg/L+CaCl2150 mg/L+Fe2(SO4)350 mg/L+KNO350 mg/L +MgSO4·7H2O 100 mg/L；超低溫保存要采集活力較高的初花期花粉，較適宜含水量為15.0%～20.0%，超低溫保存后選用自來水水沖化凍，花粉萌發率由保存前的56.04%提升到保存后的60.53%；玉蟬花花藥也可作為超低溫保存材料，保存后采用自來水水沖化凍其花粉萌發率為54.11%。[結論]保存后的花粉活力符合花粉使用活力要求，可用于指導實踐。

關鍵詞玉蟬花；花粉活力；超低溫保存

The Viability Detection and Pollen Cryopreservation ofIrisensataThunb.

JIANG Zhong-guo,DONG Dan,ZHANG Qi, WANG Ling*et al(The College of Landscape, Northeast Forestry University,Harbin, Heilongjiang 150040)

Abstract[Objective] The aim was to study pollen cryopreservation approaches ofIrisensata, which had a great significance in solving the problem of asynchronous flowering period on cross breeding and indigenous resources conservation. [Method]UsingIrisensatawhich is a cold-resistant species and has high ornamental value as material, the approaches of its pollens cryopreserving , the viability detection of hanging drop culture and the screening of vitro culture medium were studied.[Result]The results showed that the most appropriate culture medium of pollen vigour test was sucrose 150 g/L+H3BO3200 mg/L+CaCl2150 mg/L+Fe2(SO4)350 mg/L+KNO350 mg/L +MgSO4·7H2O 100 mg/L. The pollens cryopreserving should collect pollen in early flowering stage and the pollen vigour was strong .The suitable moisture content was 15.0%-20.0%. Besides, the way to unfreeze them after cryopreservation was by running water. The pollen germination rate improved from 56.04% to 60.53%. The anthers ofIrisensatacould also be materials of cryopreservation, the pollen germination rate was 54.11% unfreezing by running water after the cryopreservation. [Conclusion] The pollen viability after the cryopreservation meet needs of pollen viability application, and can be used for guiding practices.

Key wordsIrisensata； Pollen viability；Cryopreservation

收稿日期2015-11-30

作者簡介姜忠國(1993-)，男，滿族，遼寧本溪人，本科生，專業：園林。*通訊作者，教授，博士，從事園林植物種質資源研究。

基金項目中央高校基本科研業務費專項資金項目(DL13EA07，2572015BA07)；國家林業局‘948’項目(2013-4-43)；大學生國家級創新項目(201410225048)。

中圖分類號S 602.4

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)01-216-04