正交試驗法優化微波提取金絲桃苷工藝

胡小艷， 徐 蕾， 李博文

(1.萬邦生化醫藥股份有限公司，江蘇徐州 221004；2.上海海利生物技術股份有限公司，上海 201403)

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正交試驗法優化微波提取金絲桃苷工藝

胡小艷1， 徐 蕾1， 李博文2

(1.萬邦生化醫藥股份有限公司，江蘇徐州 221004；2.上海海利生物技術股份有限公司，上海 201403)

貫葉連翹(HypericumperforatumL.)屬于藤黃科金絲桃屬，貫葉連翹中含有多種具有生物活性的化學物質，其中黃酮類化合物金絲桃苷(又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷)就是其中之一。金絲桃苷具有多種藥理活性，唐敏等[1]研究證明金絲桃苷可通過清除機體自由基而發揮其抗氧化作用，從而起到對肝臟的保護作用；章家勝等[2]分析表明金絲桃苷可以抑制神經細胞上的Ca2+而起到抑制疼痛的作用；陳紅艷等[3]研究指出金絲桃苷能明顯減輕大鼠的神經病學癥狀，減小血面積，降低腦含水量，減輕腦水腫；Li等[4]報道金絲桃苷能抑制由t-BuOH誘導引起的DNA堿基氧化及細胞中氧化還原狀態變化，抑制促凋亡因子由細胞質轉移到線粒體。此外，有不少文獻報道金絲桃苷還具有抗炎[5]、抗血栓[6]、抗菌[7]、抗癌[8]、抗抑郁[9]以及增強免疫[10]的作用。

金絲桃苷的提取方法主要有乙醇熱回流提取、甲醇熱回流提取、乙醇超聲提取、甲醇超聲提取等方法，由于傳統方法所得產品純度和收率過低，成為金絲桃苷進一步研究的瓶頸，微波可使貫葉連翹中的細胞膜和細胞壁破裂，促使金絲桃苷從細胞內釋放，進而提高其提取率。該試驗用微波技術提取貫葉連翹中的金絲桃苷，以金絲桃苷提取率為考察指標，對影響該指標的各因素進行系統性研究，通過單因素試驗和正交試驗設計優化提取工藝，以期為提高金絲桃苷的提取率提供一定的理論依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑貫葉連翹飲片，蘭州安泰堂中藥飲片有限公司提供；金絲桃苷標準品(純度≥95%)，Sigma公司；乙腈和甲醇，色譜純，山東禹王實業有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2儀器與設備 高效液相色譜儀(美國Waters公司)；MAS-II型微波提取儀(上海新儀微波化學科技有限公司)；RE-52A旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；FA2004型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；Pine-tree純水機(北京湘順源科技有限公司)。

1.3試驗方法

1.3.1金絲桃苷提取。精密稱取貫葉連翹飲片10.00 g于250 mL燒杯中，乙醇浸泡放置2 h使其溶脹，在微波處理器中輻射，抽濾，濾液用旋轉蒸發儀蒸干，得到金絲桃苷提取物。

1.3.2溶液中金絲桃苷的含量測定。

1.3.2.1色譜條件。Agilent HC-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相為水乙∶腈∶磷酸緩沖液=50∶40∶10；檢測波長365 nm；流速1.0 mL/min；進樣量5 μL；柱溫30 ℃。

1.3.2.2供試液制備 。將微波提取所得金絲桃苷提取物用甲醇稀釋100倍，過0.45 μm有機濾膜，作為金絲桃苷供試液。

1.3.2.3標準曲線制備。精密稱取10.00 mg金絲桃苷對照品，用10 mL甲醇溶解制成1 mg/mL金絲桃苷對照品甲醇溶液，用甲醇稀釋得到0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 μg/mL的標準溶液。按“1.3.2.1”色譜條件測定，所得平均峰面積分別為432 927、841 043、1 703 642、3 491 964、6 831 982。以金絲桃苷標準溶液濃度為橫坐標，以其對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸，所得回歸方程為y=685 025x+5 838.9(R2=0.999 8)，表明金絲桃苷在濃度0.625～10.000 μg/mL范圍內線性關系良好。

1.3.3金絲桃苷提取率的計算。金絲桃苷提取率=(提取液中金絲桃苷含量×提取液體積×稀釋倍數)/貫葉連翹質量×100%。

1.3.4單因素試驗。

1.3.4.1輻射溫度對金絲桃苷提取率的影響。精密稱取貫葉連翹飲片10.00 g 于250 mL燒杯中，設定微波輻射時間9 min、微波功率500 W、料液比1：10，改變輻射溫度分別為20、30、40、50、60、70、80 ℃，測定提取液中金絲桃苷的含量，并計算提取率，考察輻射溫度對金絲桃苷提取率的影響。

1.3.4.2微波功率對金絲桃苷提取率的影響。精密稱取貫葉連翹飲片10.00 g于250 mL燒杯中，設定輻射溫度40 ℃、微波輻射時間9min、料液比1：10，改變微波功率分別為300、400、500、600、700、800 W，測定提取液中金絲桃苷的含量，并計算提取率，考察微波功率對金絲桃苷提取率的影響。

1.3.4.3微波輻射時間對金絲桃苷提取率的影響。精密稱取貫葉連翹飲片10.00 g于250 mL燒杯中，設定微輻射溫度40 ℃、微波功率500 W、料液比為1：10，微波輻射時間分別3、6、9、12、15 min，測定提取液中金絲桃苷的含量，并計算提取率，考察微波輻射時間對金絲桃苷提取率的影響。

1.3.4.4料液比對金絲桃苷提取率的影響。精密稱取貫葉連翹飲片10.00 g于250 mL燒杯中，設定輻射溫度40 ℃、微波功率500 W、微波輻射時間9 min，改變料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，測定提取液中金絲桃苷的含量，并計算提取率，考察料液比對金絲桃苷提取率的影響。

1.3.5正交設計法優化試驗。在單因素試驗的基礎上，分別以輻射溫度(A)、微波功率(B)、微波輻射時間(C)、液料比(D)為試驗因素，每個因素設計3個試驗水平，采用L9(34)正交設計表(表1)設計試驗，并進行方差分析，以獲得金絲桃苷提取的最優工藝參數。

表1　正交試驗因素水平

2結果與分析

2.1單因素試驗結果

圖1　輻射溫度對金絲桃苷提取率的影響Fig. 1　Effects of radiation temperature on the extraction rate of hyperoside

2.1.1輻射溫度對金絲桃苷提取率的影響。由圖1可知，隨輻射溫度增加，金絲桃苷提取率逐漸升高，繼續升高輻射溫度對金絲桃苷提取率提高不明顯。因此，選用50 ℃作為輻射溫度的最優值。

2.1.2微波功率對金絲桃苷提取率的影響。由圖2可知，在微波功率為500 W之前，隨微波功率增加，金絲桃苷提取率逐漸升高，繼續升高微波功率超過500 W之后，金絲桃苷提取率進入平臺期。因此，選用500 W作為微波功率的最優值。

圖2　微波功率對金絲桃苷提取率的影響Fig. 2　Effects of microwave power on the extraction rate of hyperoside

2.1.3微波輻射時間對金絲桃苷提取率的影響。由圖3可知，隨著微波輻射時間的增加，金絲桃苷提取率逐漸升高，當達到9 min時，金絲桃苷提取率達最大；再增加輻射時間，金絲桃苷提取率下降。因此，輻射時間為9 min是最優值。

2.1.4料液比對金絲桃苷提取率的影響。由圖4可知，隨著料液比的增加，金絲桃苷提取率逐漸升高，當料液比達1∶20時，金絲桃苷提取率達最大；料液比繼續增大時，金絲桃苷提取率增加不明顯。因此，料液比優選為1∶20。

圖3　微波輻射時間對金絲桃苷提取率的影響Fig. 3　Effects of microwave radiation time on the extraction rate of hyperoside

圖4　料液比對金絲桃苷提取率的影響Fig. 4　 Effects of solid-liquid ratio on the extraction rate of hyperoside

2.2正交試驗結果由表2可知,輻射溫度(A)、微波功率(B)、微波輻射時間(C)、料液比(D)4個因素對金絲桃苷提取率的影響程度依次為輻射溫度(A)>微波功率(B)>料液比(D)>微波輻射時間(C)，得出最優工藝為A2B1C3D3。

對結果進行方差分析發現，因素A(輻射溫度)和因素B(微波功率)的F值均介于F0.01(2，2)和F0.05(2，2)之間， 即0.010.10，料液比對金絲桃苷的提取率無顯著性影響。

綜上所述,微波法提取貫葉連翹中金絲桃苷的最佳工藝條件為輻射溫度50 ℃、微波功率500 W、微波輻射時間9 min、料液比1∶20。

表2　正交試驗設計結果

3結論與討論

應用微波技術提取貫葉連翹中的金絲桃苷，以金絲桃苷提取率為考察指標，采用正交試驗法考察輻射溫度、微波功率、微波輻射時間及料液比對貫葉連翹中金絲桃苷提取率的影響，建立微波提取貫葉連翹中金絲桃苷的最佳工藝，結果表明，貫葉連翹微波提取金絲桃苷的工藝所選擇的4個影響因素對金絲桃苷提取率的影響程度依次為輻射溫度>微波功率>料液比>微波輻射時間，微波提取金絲桃苷的最優工藝為輻射溫度50 ℃、微波功率500 W、微波輻射時間9 min、料液比1∶20。該試驗得到的微波提取工藝條件可靠、穩定性好，可用于貫葉連翹中金絲桃苷的提取。

參考文獻

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[3] 陳紅艷，王建華，任振學，等．金絲桃苷對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的防護作用[J].中西醫結合學報，2006，4(5)：526-529．

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摘要[目的]優選貫葉連翹中金絲桃苷微波提取工藝。[方法]以金絲桃苷提取率為考核指標，采用正交試驗法考察輻射溫度、微波功率、微波輻射時間及料液比對貫葉連翹中金絲桃苷提取率的影響，建立微波提取貫葉連翹中金絲桃苷的最佳工藝。[結果]微波提取金絲桃苷的最佳工藝條件為輻射溫度50 ℃、微波功率500 W、微波輻射時間9 min及料液比1∶20。[結論]通過以上試驗得到的微波提取工藝條件可靠，穩定性好，可用于貫葉連翹中金絲桃苷的提取。

關鍵詞貫葉連翹；金絲桃苷；微波提取；正交試驗

Optimization of Microwave Extraction Process of Hyperoside by Orthogonal Test

HU Xiao-yan1, XU Lei1，LI Bo-wen2(1. Jiangsu Wanbang Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd., Xuzhou, Jangsu 221004; 2.Shanghai Hile Bio-technology Co., Ltd., Shanghai 201403)

Abstract[Objective] To optimize the optimal microwave extraction process for hyperoside fromHypericumperforatumL. [Method] With the extraction rate of hyperoside as the evaluation index, effects of factors were studied in orthogonal test, such as radiation temperature, microwave power, microwave radiation time and solid-liquid ratio. [Result] The optimal extraction technology for microwave extraction process of hyperoside fromH.perforatumwere established, which was 50 ℃ radiation temperature, 500 W microwave power, 9 min radiation time, and 1∶20 solid-liquid ratio. [Conclusion] This extraction technology was reliable and stable, and was suitable for the extraction of hyperoside fromH.perforatum.

Key wordsHypericumperforatumL.; Hyperoside; Microwave extraction; Orthogonal test

收稿日期2015-12-07

作者簡介胡小艷(1980- )，女，陜西西安人，工程師，博士，從事新藥開發研究。

中圖分類號S 567

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)01-165-03