ATP生物發光法在快速檢測物體表面清潔度中的應用

劉 陽,牟金明

(吉林農業大學農學院，吉林長春 130000)

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ATP生物發光法在快速檢測物體表面清潔度中的應用

劉 陽,牟金明*

(吉林農業大學農學院，吉林長春 130000)

細菌總數檢測是食品衛生學領域的重要檢測指標，主要是用來判斷食品等被污染的程度。對細菌總數進行快速準確地檢測一直是該領域內重要的研究課題。對細菌總數進行檢測的國標方法是平板計數法[1]，該方法測試時間長，操作繁瑣，不適合現場檢測。檢測的時效性在食品等行業尤為重要，在加工過程中實時的監控生產環境更是防患于未然的根本方法，顯然這是國標法無法做到的。ATP生物發光微生物檢測技術是一種以生物發光反應為基礎的快速檢測技術[2]，此技術用生物發光法測定細菌體中ATP的含量，再利用細菌體ATP含量與菌落總數成正比這一原理，推算出菌落總數[3]。與傳統的細菌總數國標平板計數法相比，ATP生物發光微生物檢測技術具有操作簡便、快速靈敏、成本低廉、綠色環保等優點。利用ATP發光法實時檢測細菌總數可以很好地彌補國標法的不足，兩者相互輔助，相得益彰。近幾年，在我國ATP發光法也得到了廣泛的應用。筆者以ATP生物發光微生物檢測技術為指導，通過提取重組的螢火蟲熒光素酶，配制完成一體化的熒光反應試劑并研究其在物體表面清潔度快速檢測方面中的應用。

1材料與方法

1.1材料試驗中所用到的氯化鈉(NaCl)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritionX-100)等生化試劑均為國產分析純，廣東華大技術有限公司；0.4 μm的硝酸纖維素膜，美國Millipore公司；蛋白純化所用儀器為液相色譜系統AKTA PURIFIER，美國GE公司；檢測熒光強度儀器為BHP9505微量光度計，北京濱松光子技術有限公司。

1.2試劑制備

1.2.1ATP標準溶液的配制。用分析天平稱取0.010 1 g ATP白色粉末溶于20 mL滅菌的雙蒸水中，配制成1 mmol/L的標準ATP母液，分裝到2 mL無菌EP管中，放入-80 ℃冰箱冷凍保存備用。使用時稀釋即得到濃度為10 μmol/L的ATP標準溶液。

1.2.2一體化熒光反應試劑的制備(終濃度)。Tris-HCl pH 7.8 50 mmol/L；KCl 100 mmol/L；MgCl22 mmol/L；丙三醇(glyercol)10%；聚乙二醇辛基苯基醚(TritionX-100)1%。

1.2.3PBS緩沖液的配制。pH 7.8 的0.2 mol/L NaH2PO48.5 mL與0.2 mol/L Na2HPO491.5 mL混合。

I=Imax×cATP/Km+cATP

式中，Imax為最大發光強度；Km為1×10-4。由上式可知，當cATP遠小于Km時，I正比于樣品中的cATP。因此可通過測定發光體系的I值來定量ATP濃度[5]。

正常條件下細菌體內的ATP含量趨近恒定，為10-18mol[6]。以光電倍增管為核心采光部件的光度計都能檢測低于 10 pg分子的ATP，這就使快速、準確檢測細菌成為可能。

1.4蛋白純化螢火蟲熒光素酶質粒由美國Cellex公司 CEO James惠贈，該質粒載體為pET15b-sumo 。將該質粒轉化到感受態細胞為BL21DE3中37 ℃培養16 h，從含AMP(氨芐西林)100 μg/mL的平皿中挑取單克隆到5 mL的 LB培養基中(AMP 50 μg/mL)，37 ℃搖動培養5 h，按接種比例1∶1 000將前培養樣品轉接到3 L 的LB 培養基中(AMP 50 μg/mL)37 ℃搖動培養，直至OD值到 0.6～0.7，加入0.3 mmol/L異丙基硫代-β-D-半乳糖(ITPG)后，改成18 ℃搖動培養16 h。4 000 r/min、30 min、4 ℃低溫離心收集發酵細菌，細菌超聲波破碎后，12 000 r/min、4 ℃低溫離心30 min，取上清液。將上清液用0.45 μm一次性硝酸纖維素濾膜過濾后通過Ni-NTA(GE Healthcare)初步純化，洗脫的樣品再次通過陽離子sp(GE Healthcare)純化得到重組的螢火蟲熒光素酶，將得到的樣品加入10% 甘油凍存在-80 ℃冰箱中保存備用。

1.5試驗方法

1.5.1ATP標準曲線的建立。 用雙蒸水將濃度為10 μmol/L的ATP標準溶液，按1∶10梯度比例稀釋成1 μmol/L 、100 nmol/L、10 nmol/L 、1 nmol/L、 100 pmol/L、10 pmol/L系列溶液(注意：ATP溶液極易降解，稀釋好的溶液應放在冰上)。用微量移液器吸取50 μL熒光反應試劑(Tris-HCl pH 7.8 50 mmol/L；KCl 100 mmol/L；MgCl22 mmol/L ；glyercol 10%)，加入熒光反應比色杯中，然后分別加入5 μL稀釋后的各梯度ATP溶液，用微量光度計檢測相對熒光值(RLU)，重復上述步驟。

1.5.2細菌總數標準曲線的建立。 將從冰箱中取出的大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌3種細菌分別在LB培養基中復蘇培養6 h，將3種不同濃度的菌液按1∶1∶1比例進行混合搖勻后備用。用無菌的PBS緩沖液將混合菌液連續10倍稀釋，稀釋至可以得到單菌落的濃度梯度(10-7～10-9)為止，用傾注平板法將營養瓊脂培養基注入1 mL稀釋的混合菌液，每個稀釋梯度做2個平行試驗，在37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，對平板上形成的單菌落進行計數，單位用CFU/mL表示(平皿計數法參見國標，GB4789. 2-2010)。同時檢測相對應梯度菌液的相對熒光值(RLU)，即用移液槍吸取混合稀釋好的菌液10 μL加入配制好的一體化熒光反應試劑50 μL，輕輕吸打混勻，推入至微量光度計檢測管內讀取相對熒光值(RLU)，每個梯度測2次，取平均值計數。分別以相對熒光值對數值即lg(RLU)和菌落總數對數值lg(CFU/mL)為橫坐標和縱坐標作圖。

1.5.3物體表面細菌總數檢測及標準曲線的建立。 取無菌棉簽，將棉簽頭部放入無菌的裝有2 mL PBS緩沖液的EP管中浸濕，然后用此棉簽在被測物體表面均勻涂擦，并隨之轉動棉簽，采樣總面積為10×10 cm2。將取完樣的棉簽頭部再次放入到原EP管中渦旋搖晃洗滌數次，即得到物體表面菌樣。將得到的菌樣進行菌落總數和相對熒光值檢測(方法同“1.5.2”)。分別以相對熒光值對數值lg(RLU)和物表菌落總數對數值lg(CFU/mL)為橫坐標和縱坐標作圖。

2結果與分析

2.1重組螢火蟲熒光素酶檢測ATP活力 螢火蟲熒光素酶分子量為60 kD，pET-sumo載體含有20 kD的sumo標簽蛋白，野生型的螢火蟲熒光素酶經過發酵誘導后大多在包涵體里，幾乎沒有可溶性的目的蛋白。為此在構建時加入sumo促溶標簽共同表達，以增加該蛋白的可溶性，在試驗的過程中，如果用sumo酶(promega)進行標簽切除，蛋白變得極不穩定，出現大量沉淀，所以最終得到的蛋白是含有20 kD sumo標簽的重組蛋白，見圖1。為檢驗重組蛋白是否仍具有良好的活力，試驗分別以相對發光值對數值lg(RLU)和ATP濃度值lg[ATP]為橫坐標和縱坐標作圖。圖2 表明，在ATP濃度為10 pmol/L～10 μmol/L范圍內，ATP濃度與相對熒光值(RLU)呈較好的線性關系，相關性R2=0.986 9。

圖1　重組螢火蟲熒光素酶SDS-PAGE 10%Fig.1　Recombinant firefly luciferase SDS-PAGE 10%

圖2　ATP生物發光法標準曲線Fig.2　Standard curve of the ATP bioluminescent method

2.2ATP生物發光法檢測結果與細菌總數的相關性在馬妮等的研究中，利用ATP發光法檢測細菌總數至少需要2步，首先要加入裂解液去釋放細菌中的ATP，再加入發光反應試劑與菌體釋放出的ATP反應檢測光值[7]。因為該發光反應極其靈敏，并且生活中遍布著大量游離的ATP，使得每多加一步反應過程都會增加污染的可能。筆者在試驗的過程中嘗試了多種去污劑，最后篩選出既可以快速裂解細菌又不會影響發光的非離子型表面活性劑TritionX-100[8]。

圖3試驗結果表明，加入TritionX-100的反應試劑，不僅得到了相對熒光值與菌落總數良好的線性關系，而且也完成了裂解與發光反應的一體化試劑。以此構建數學模型，重新做10組試驗，方法同“1.5.2”，將得到的RLU值代入到y=1.708 8x-1.942 5中，算出y轉換成菌落總數預測值。預測值與平板計數法得到的菌落總數值實際值結果見表1。將表1中的菌落總數預測值與實際值進行相關性分析得到表2。結果表明，菌落總數實際值與菌落總數預測值相關性系數r=1.000，呈極顯著正相關(P<0.01)，即ATP生物發光法檢測混合菌液菌落總數與國標平板計數法檢測結果基本一致。

2.3ATP生物發光法快速檢測物體表面細菌總數對4種表面大小為10×10 cm2的不同樣品物體清洗前后進行ATP生物發光法對比檢測，試驗結果見表3。說明應用ATP生物發光法檢測物體表面清洗前后相對熒光值差異顯著，在實際檢測中可以快速地定性判斷物體表面的清潔程度。

圖3　ATP生物發光法細菌總數標準曲線Fig.3　Standard curve of total bacterial count in ATP bioluminescent method

序號No.相對熒光值(RLU)Relativelightunit相對熒光值對數lg(RLU)XLogarithmvalueofrelativelightunit菌落總數預測值對數lg(CFU)YLogarithmvalueofthepredictedvalueoftotalbacterialcount菌落總數預測值Predictedvalueoftotalbacterialcount∥CFU/mL菌落總數實際值Actualvalueoftotalbacterialcount∥CFU/mL19722.9876662.98766615003200212513.0972573.09725722003200338743.5881603.5881601500020000454183.7338393.733839270000320000586433.9366653.9366656100007000006126304.1014034.101403120000018000007354194.5492364.549236680000072000008495524.6950614.69506112000000200000009745084.8722034.8722032400000020000000105224905.7180785.718078670000000700000000

表2混合菌液菌落總數預測值與實際值相關性分析

Table 2Correlation analysis of the actual and predicted values of the mixed bacteria

項目Item相關Correlation菌落總數預測值Predictedvalueoftotalbacterialcount菌落總數實際值Actualvalueoftotalbacterialcount菌落總數預測值Pearson相關性11.000**Predictedvalueoftotal顯著性(單側)0.000bacterialcountN1010菌落總數實際值Pearson相關性1.000**1Actualvalueoftotal顯著性(單側)0.000bacterialcountN1010

注：**表示極顯著相關。

Note： ** indicated extremely significant correlation.

表3不同種類的同一物體表面清洗前后檢測相對熒光值(RLU)結果對比

Table 3Comparison of relative light units(RLU)of the same object surface before and after cleaning

檢測項目Detectionitem清洗前(RLU)Beforecleaning自來水(RLU)Runningwater酒精消毒(RLU)Alcoholsterilization刀Knife63516218案板Choppingboard83929721手Hand3890806102辦公桌Officetable1598293236

圖4　ATP生物發光法檢測不同餐盤表面菌落總數標準曲線Fig.4　Standard curve of total bacterial count in different plate surfaces by ATP bioluminescent microbial detection

進一步對食堂的130個不同餐盤表面進行菌落總數和相對熒光值同步檢測，方法同“1.5.3”。圖4將2組數據進行線性擬合得到良好的線性關系。同樣以此標準曲線為數學模型，重新檢測食堂10個不同餐盤的表面，將得到的RLU值代入到公式y=0.992x+0.367 4中，得到y換算成菌落總數預測值，預測值與平板計數法得到的菌落總數實際值結果見表4。將表4中菌落總數的預測值和實際值進行相關性分析得到表5。結果表明，ATP生物發光法測定的盤子物體表面菌落總數實際值和菌落總數預測值相關性系數r=0.998，呈極顯著的正相關(P<0.01)。即ATP生物發光法檢測物體表面的結果與國標平板計數法基本一致，可用此法進行物體表面清潔度的快速檢測。

表4　10組餐盤表面菌落總數的預測值與實際值

表5　不同餐盤表面菌落總數的預測值與實際值相關性分析

注：**表示極顯著相關。

Note： ** indicated extremely significant correlation.

3結論與討論

3.1結論該研究建立的ATP生物發光微生物檢測技術檢測的相對熒光值與物體表面的菌落總數存在良好的線性相關性，且ATP生物發光法操作簡便、快速靈敏、成本低廉、綠色環保，可快速、準確地檢測物體表面清潔度。

3.2討論

3.2.1建立食品及服務等行業的半定量標準。ATP發光法實時檢測細菌總數應用廣泛，在生產設施清潔、消毒效果檢測，原、輔料細菌總數檢測，生產設備關鍵控制點(例如供水、通風閥門)、衛生學監測，化妝品及乳品微生物總數檢測中都可以起到很好的實時監控的作用，但是目前只能作為企業內部生產環節控制的輔助手段。統計結果證實，凡ATP熒光法顯示衛生水平有所改善，則對應的平皿計數細菌總數也會顯著減少；如果檢測點ATP檢測結果偏高，24 h后必然大量滋生細菌導致嚴重污染。如能通過國標法和ATP熒光法兩者之間建立起符合食品安全衛生標準的有效范圍(如合格、警告、不合格)；將會大大增加食品企業的產品合格率。

3.2.2ATP發光法實時檢測細菌的不足。 ATP發光法最大的優勢就是檢測過程快速，且靈敏度極高，但該方法在不同的大環境下容易受到影響，不同的食品企業會在食品中加入種類繁多的添加劑，其中有些會影響到光值的穩定性，這種特性就制約著ATP發光法檢測細菌的普遍性，使得該檢測方法還沒能進入國家標準檢測方案，所以目前只能是企業內部建立自我衛生監控，還無法成為國家衛生執法部門統一有效的檢測手段。ATP發光法檢測細菌的快速、便捷是顯而易見的，如何克服該方法的不足將是今后努力的目標。

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摘要[目的]建立一種快速、準確檢測物體表面清潔度的方法。[方法]以ATP生物發光微生物檢測技術為指導，提取重組的螢火蟲熒光素酶并配制成熒光反應試劑，測定其與ATP發光反應值的線性關系；根據ATP含量與細菌數量成正比例關系原理, 測定物體表面ATP發光強度值，同時用國標平皿計數法測定其菌落總數，兩者對比分析。[結果] ATP生物發光法檢測的相對熒光值與物體表面的菌落總數存在良好的線性相關性，利用ATP發光法實時檢測細菌總數可以很好地彌補國標法的不足。[結論] ATP生物發光法與傳統的細菌總數國標平板計數法相比較具有操作簡便、快速靈敏、成本低廉、綠色環保等優點，可以快速、準確地檢測物體表面清潔程度。

關鍵詞ATP生物發光法；菌落總數；物體表面；清潔度

Application of ATP Bioluminescent Method in Rapid Detection of Object Surface Cleanliness

LIU Yang, MU Jin-ming*(College of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun, Jilin 130000)

Abstract[Objective] To establish a rapid and accurate detection method for object surface cleanliness. [Method] With ATP bioluminescent microbial detection technology as the guidance, recombinant firefly luciferase was extracted in order to prepare fluorescence reaction reagent. Its linear relation with ATP response value was detected. According to the principal of positive correlation between ATP content and bacterial population, ATP luminous intensity of object surface was detected. Total bacterial count was calculated by national standard plate counting method. And comparative analysis was carried out. [Result] There was good linear relationship between relative fluorescence unit and total bacterial count of object surface. Real-time detection of total bacteria by ATP bioluminescent method could make up for the disadvantages of national standard. [Conclusion] Compared with traditional national standard plate counting method, ATP bioluminescent microbial detection technology is more simple, rapid, sensitive and cheap. And it can rapidly and accurately detect the cleanliness of object surface.

Key wordsATP bioluminescent method; Total bacterial count; Object surface; Cleanliness

收稿日期2015-12-04

作者簡介劉陽(1987-)，女，遼寧丹東人，碩士，從事農田生態與作物種植規劃研究。*通訊作者，副教授，博士，從事農田生態與作物種植規劃研究。

中圖分類號TS 207.4

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)01-125-04