油茶籽及其餅粕對黃曲霉的拮抗作用

張飛飛， 王亞萍， 姚小華， 仲山民， 費學謙

(1.中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，浙江富陽 311400；2.浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江臨安 311300)

?

油茶籽及其餅粕對黃曲霉的拮抗作用

張飛飛1,2， 王亞萍1*， 姚小華1， 仲山民2， 費學謙1

(1.中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，浙江富陽 311400；2.浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江臨安 311300)

油茶是我國南方地區主要的木本油料作物[1]，油茶籽可以提取得到油茶籽油，因其具有重要的保健功能而深受消費者喜愛[2]。但是油茶籽在儲存、運輸和加工過程中卻存在著被有毒有害物質污染的風險[3]，在這一過程中黃曲霉毒素因其致癌性強、性質穩定而備受關注。黃曲霉毒素多存在于霉變的糧油制品中[4]，為晶體物質，易溶于氯仿、甲醇和二甲基亞砜等中等極性溶劑，能溶于水，在紫外光照射下產生熒光。農產品中的黃曲霉毒素主要以4種常見形式污染食品，即黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)和黃曲霉毒素G2(AFG2)，其中，以AFB1最為常見，毒性最強[5]。

筆者以油茶籽及其餅粕為試材，采用不同極性的溶劑進行提取，對所得粗提物抑制黃曲霉生長的效果進行了較為系統的研究，其目的就是要從中篩選出對黃曲霉生長有較好抑制效果的粗提物，并掌握其提取工藝與條件，為進一步分離與提純，了解并掌握其具體的功效成分與作用機理，進而為油茶生產實踐與加工利用中更好地預防黃曲霉的污染，有效降低黃曲霉毒素對人體的危害等提供一定的理論依據。

1材料與方法

1.1材料原料：油茶籽，取自于浙江地區的普通油茶籽，新鮮，完整，無霉變腐爛等；油茶粕，為油茶籽榨油后剩余的油茶餅；黃豆，購于當地農貿市場，產于浙江地區的普通黃豆，新鮮，完整，無霉變腐爛等；花生，購于當地農貿市場，產于浙江地區的普通花生，新鮮，完整，無霉變腐爛等。

主要儀器：旋轉蒸發儀RE-52A，上海亞榮生化儀器廠；普通水浴鍋；生化培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；BSC-1000ⅡA2生物安全柜，蘇州蘇凈安泰空氣技術有限公司；Agilent1290高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司；LDZF-30KB立式蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠。

1.2方法

1.2.1人工接種黃曲霉菌的試驗。分別稱取油茶籽、油茶粕、黃豆、花生4種材料，放置于熱風烘干箱中60 ℃烘干12 h,放入干燥器中冷卻至室溫，各稱取300 g，粉碎過20目篩，然后用濕熱滅菌法滅菌，接種黃曲霉(用配制好的黃曲霉孢子懸浮液進行接種，黃曲霉孢子懸浮液的濃度為1×106CFU/mL，每個平板接種黃曲霉孢子懸浮液5 mL)。在30 ℃培養箱中培養20 d，每4 d取樣1次，進行觀察，觀察4種試驗材料接種黃曲霉后的感染及生長情況，并測定各樣品中AFB1的含量。

1.2.2油茶籽和油茶粕粗提物抑制黃曲霉生長的試驗。選取無霉變感染的油茶籽、脫脂后的油茶粕于60 ℃烘干，粉碎后過20目篩，分別用不同極性的溶劑(乙醚、80%乙醇、水)加熱回流提取。料液比1∶5 g/mL，每種溶劑重復提取3次，時間分別為3、2、1 h，將每種溶劑3次所得提取液合并、濃縮，將提取液放置于鋁盒中，在熱風干燥箱中60 ℃烘干至恒重，稱重，計算粗提物得率。

用無菌水將各油茶籽粗提物配制成400 mg/mL的水溶液。用滅菌槍頭吸取黃曲霉孢子懸液0.5 mL，均勻涂布于PDA平板上，每個平板上放直徑6 mm的無菌濾紙片3片，每個紙片滴加0.05 mL粗提物，每處理做3個重復。

1.2.3檢測方法。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2由國家林業局經濟林產品質量檢驗檢測中心采用國家標準GB/T18979-2003《食品中黃曲霉毒素的測定》進行檢測。

2結果與分析

2.1不同試樣感染黃曲霉毒素的情況黃曲霉一般在25～30 ℃生長較好[6]，以油茶籽、油茶粕為材料，以黃豆、花生為對照，人工接種黃曲霉，在30 ℃的恒溫培養箱中進行培養，每4 d取樣1次，及時對所取樣品所含AFB1的含量進行測定，結果見表1。

從表1中可以看出，在人為接種黃曲霉的情況下，油茶籽和油茶粕均未產生黃曲霉毒素B1，花生的5個批次樣品中都產生了黃曲霉毒素B1。從表1可知，花生中AFB1的含量隨著時間的延長逐漸增加，呈上升趨勢；油茶籽和油茶粕在5次提取的樣品中并未檢測到AFB1。筆者推測認為，油茶籽和油茶粕中含有某些成分對黃曲霉的生長產生一定的抑制作用，進而減少AFB1的產生，甚至是不產生AFB1。

表1　不同試樣產生黃曲霉毒素B1的含量

注：AFB1的檢出限為1.0 μg/kg。

Note: Detection limit of AFB1 was 1.0 μg/kg.

2.2不同溶劑提取對油茶籽和油茶粕粗提物得率的影響按試驗設計要求，將油茶籽粉、油茶粕粉放置于烘箱中60 ℃烘干，準確稱量烘干的油茶籽和油茶粕各40 g，各3份，分別置于不同的提取瓶中，分別用純凈水、80%乙醇、乙醚作為提取劑，溶劑加入量為200 mL，然后均采用熱回流提取法[7]提取3次，提取的時間分別為3、2和1 h，將3次所得提取液混合，并置于50 ℃烘箱中烘干至恒重，稱量，計算結果見表2。

表2　不同溶劑提取油茶籽、油茶粕粗提物的得率

由表2可知，采用不同極性的溶劑來提取油茶籽、油茶粕中的粗提物，其得率是完全不同的，有明顯差異。其中，用乙醚提取的油茶籽粗提物的得率最高，達57.74%；其次是用純凈水提取的油茶籽粗提物的得率，可達38.90%；油茶籽80%乙醇的提取率較低，為18.42%；最低的是用乙醚作為提取劑，提取油茶粕中的粗提物，其得率僅為0.27%；而油茶粕中的粗提物，不論是用純凈水提取，還是用80%乙醇提取，其得率均在22%左右。

2.3油茶籽和油茶粕粗提物對黃曲霉的抑制效果按“1.2.2”的方法測量抑菌圈直徑，計算抑菌率[8]，具體結果如表3所示。

從表3中可以看出，油茶籽和油茶粕的水提物對黃曲霉的生長有較好的抑制效果，抑菌率分別達到88.87%和87.96%，兩者的差異并不明顯，均可用于抑制黃曲霉的生長，相對來說，采用油茶粕的水提物更為經濟、實用。油茶籽的乙醚提取物對黃曲霉的生長也有一定的抑制作用，抑菌率可達61.11%，也可適當予以應用。油茶籽和油茶粕的乙醇提取物，以及油茶粕的乙醚提取物對黃曲霉的生長都沒有抑制效果。

從圖1、2可以看出，在恒溫培養4 d后，PDA平板上的黃曲霉已經大量生長，而在有粗提物的濾紙片的周圍，只生長了少量的白色菌絲，說明油茶籽和油茶粕的水提物能夠明顯減緩黃曲霉的生長。

表3　油茶籽和油茶粕粗提物對黃曲霉的抑制效果

注：“/”為沒有抑制效果。

Note: “/” indicated no inhibitory effects.

圖1　油茶籽水提取物抑制黃曲霉的效果Fig. 1　Inhibitory effects of water extracts from camellia seed on Aspergillus flavus

圖2　油茶粕水提取物抑制黃曲霉的效果Fig. 2 Inhibitory effects of water extracts from seed cake on Aspergillus flavus

從圖3可以看出，油茶籽的乙醚提取物在培養皿中也形成較明顯的抑菌圈，表明它同樣能抑制黃曲霉的生長。

圖3　油茶籽乙醚提取物抑制黃曲霉的效果Fig. 3　Inhibitory effects of diethyl ether extracts from camellia seed on Aspergillus flavus

至于上述這3種粗提物中究竟是哪一種活性物質在起抑菌作用，還是多種活性物質協同作用的結果，筆者認為還需要進一步的分離提純，并進行大量的驗證試驗才能逐步確定。

3結論與討論

試驗中發現，在人為接種黃曲霉的情況下，油茶籽、油茶粕均未產生黃曲霉毒素B1，表明油茶籽、油茶粕都具有一定的抗黃曲霉生長與產毒作用。

研究結果表明，采用不同極性的溶劑來提取油茶籽、油茶粕中的粗提物，其得率是完全不同的，有明顯差異。其中，用乙醚提取的油茶籽粗提物的得率最高，達57.74%；其次是用純凈水提取的油茶籽粗提物的得率，可達38.90%；油茶籽80%乙醇的提取率較低，為18.42%；最低的是用乙醚作為提取劑提取油茶粕中的粗提物，其得率僅為0.27%；而油茶粕中的粗提物，不論是用純凈水提取，還是用80%乙醇提取，其得率均在22%左右。

進一步研究發現，用不同溶劑來提取油茶籽、油茶粕所得的不同粗提物，對黃曲霉生長的抑制效果截然不同。其中，油茶籽、油茶粕的水提物對黃曲霉生長的抑制效果較好，其抑菌率分別達到88.87%和87.96%，兩者的差異并不明顯；油茶籽的乙醚提取物對黃曲霉的生長也有一定的抑制作用，其抑菌率可達61.11%；而油茶籽、油茶粕的乙醇提取物，以及油茶粕的乙醚提取物對黃曲霉的生長都沒有抑制效果。

從油茶籽、油茶粕中提取所得的不同粗提物內，對黃曲霉的生長起抑制作用的成分，到底是哪一種活性物質，還是多種活性物質協同作用的結果，還有待于做進一步的分離提純，及大量的驗證試驗。

參考文獻

[1] 姚小華.油茶資源與科學利用研究[M].北京:科學出版社, 2012:1.

[2] 尹嶺,張笑明, 李莉，等.茶油對兔血脂及動脈粥樣硬化的影響[J].食品科學,2011,32(7): 289-290.

[3] 中國糧油學會油脂分會.對“油茶籽油苯并(a)芘超標質量事件”有關問題的意見[J].中國油脂，2010,35(11):22.

[4] 蔡靜平.真菌對食品安全性的影響[J].糧油食品微生物學，2003(1):296-301.

[5] 丁丁.香菇多糖及其衍生物抑制 AFB1合成及其抑制機理研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2013.

[6] 王守經，祝清俊，胡鵬. 花生及其制品的黃曲霉毒素污染與防控措施[J].中國食物與營養，2010(3):14-16.

[7] 郝彩琴，冷曉紅，郭鴻雁，等.不同提取方法對寧夏六盤山栽培秦艽中龍膽苦苷提取率的影響[J].西北藥學雜志，2013,28(1)：13-15.

摘要[目的] 從油茶籽及其餅粕中篩選出對黃曲霉生長有較好抑制效果的粗提物，并掌握其提取工藝與條件。[方法]以油茶籽及其餅粕為試材，采用不同極性的溶劑進行提取，對所得粗提物抑制黃曲霉生長的效果進行系統的研究。[結果]試驗表明，油茶籽、油茶粕都具有一定的抗黃曲霉生長與產毒作用。用不同溶劑提取油茶籽、油茶粕中的粗提物，其得率是有明顯差異的，用乙醚提取的油茶籽粗提物的得率最高，達57.74%；其次是用純凈水提取的油茶籽粗提物的得率，可達38.90%；最低的是用乙醚作為提取劑提取的油茶粕粗提物，其得率僅為0.27%。粗提物不同，對黃曲霉生長的抑制效果也不同，其中，油茶籽、油茶粕的水提物對黃曲霉生長的抑制效果較好，其抑菌率分別達到88.87%和87.96%；油茶籽的乙醚提取物也有一定的抑制作用，其抑菌率可達61.11%；而油茶籽、油茶粕的乙醇提取物，以及油茶粕的乙醚提取物對黃曲霉的生長都沒有抑制效果。[結論] 研究可為油茶生產與加工利用中更好地預防黃曲霉的污染，有效降低黃曲霉毒素對人體的危害等提供一定的理論依據。

關鍵詞油茶籽；油茶粕；黃曲霉；抑制

Antagonistic Effects of Camellia Seed and Seed Cake onAspergillusflavus

ZHANG Fei-fei1,2, WANG Ya-ping1*, YAO Xiao-hua1et al (1. Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fuyang, Zhejiang 311400; 2. School of Agricultural and Food Science, Zhejiang A & F University, Lin’an, Zhejiang 311300)

Abstract[Objective] To screen the crude extracts from camellia seed and seed cake which had relatively good inhibitory effects on the growth ofAspergillusflavus, and to grasp the extraction technology and conditions. [Method] With camellia seed and seed cake as the research materials, extraction was carried out by solvents with different polarities. Systematic study of the antagonistic effects of camellia seed and seed cake onA.flavuswas carried out. [Result] Both camellia seed and seed cake had certain effects of toxin production and resistance effects onA.flavusgrowth. The extraction rates of crude extracts from camellia seed and seed cake varied greatly by different solvents, showing significant differences. Among them, crude extracts from camellia seed by diethyl ether had the maximum extraction rate (57.74%), followed with the crude extracts from camellia seed by purified water (38.90%). Crude extracts extracted by diethyl ether had the minimum extraction rate, which was only 0.27%. Different crude extracts showed different inhibitory effects on the growth ofA.flavus. Among them, water extracts from camellia seed and seed cake had relatively good inhibitory effects on the growth ofA.flavus. And their inhibitory rates reached 88.87% and 87.96%, respectively. Extracts from camellia seed by diethyl ether also had certain inhibitory effects, and the inhibitory rate reached 61.11%. Extracts from camellia seed and seed cake by ethanol showed no inhibitory effects on the growth ofA.flavus, as well as the extracts from seed cake by diethyl ether. [Conclusion] This research provides certain theoretical foundation for the prevention ofA.flavuspollution during production and process of camellia, and effectively reduces the damage ofA.flavusto human body.

Key wordsCamellia seed; Seed cake;A.flavus; Inhibition

收稿日期2015-10-30

作者簡介張飛飛(1988- )，女，山東五蓮人，碩士研究生，研究方向：食品加工與安全研究。*通訊作者，助理研究員，碩士，從事經濟林產品的加工與利用研究。

基金項目國家自然科學基金項目(31400577)；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金項目(CAFYBB2014QB036)。

中圖分類號S 789.5

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)01-108-04