基因芯片法檢測體檢人群ALDH2基因多態性＊

徐筱婧，瞿　浩，張　華△

(貴州省人民醫院：1.檢驗科；神經內科，貴州貴陽 550002)

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·論著·

基因芯片法檢測體檢人群ALDH2基因多態性＊

徐筱婧1，瞿浩2，張華1△

(貴州省人民醫院：1.檢驗科；神經內科，貴州貴陽 550002)

摘要:目的采用基因芯片法檢測體檢人群ALDH2基因，評價該方法應用于臨床檢測的可行性。方法檢測對象為100例體檢人員，采用基因芯片檢測法，檢測ALDH2基因第487突變位點3個不同的基因分型：GG型、GA型、AA型。結果共檢出GG型72例，GA型26例，AA型2例。結論基因芯片檢測法可滿足臨床ALDH2基因檢測的要求，具有較好的臨床應用前景。

關鍵詞:ALDH2基因；芯片檢測

人乙醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase，ALDH2)是一種位于12號染色體編碼基因呈高度多態性的四聯體蛋白，為酒精代謝的關鍵酶[1]，芯片檢測法是近年來興起的一項基因檢測技術，為探討該方法臨床應用可行性，筆者對100例體檢樣本進行了檢測，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料2010年11月至2011年9月期間本院體檢人員，共100例。其中男79例，女21例，年齡20～66歲，平均(42.29±7.52)歲,遵循受檢者知情自愿原則。

1.2儀器與試劑上海百傲公司雜交儀、掃描儀；上海百傲科技公司ALDH2基因檢測試劑盒、ALDH2基因檢測芯片判別系統；天根生化科技有限公司全血基因組DNA提取試劑盒；北京博奧科技公司DNA定量儀、普通PCR擴增儀。

1.3方法

1.3.1標本采集與處理采集外周靜脈血2 mL(EDTA抗凝)，用上海百傲科技有限公司血液基因組DNA提取系統(離心柱型)試劑盒，提取全血DNA。

1.3.2基因組DNA電泳分析2%瓊脂糖凝膠，6×Loading buffer 1 μL與5 μL DNA樣本混勻后點樣，5 μL Marker點樣，100 V電泳30 min，凝膠成像系統讀取結果見圖2。

1.3.3PCR反應按試劑盒說明書準備反應體系，見表1。PCR反應程序為：50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，35 cycles;72 ℃ 5 min。

1.3.4PCR產物電泳分析2%瓊脂糖凝膠，6×Loading buffer 1 μL與5 μL PCR擴增產物混勻后點樣，5 μL Marker點樣，100 V電泳30 min，凝膠成像系統讀取結果見圖3。

表1　　PCR擴增反應體系

1.3.5雜交按上海百傲基因檢測試劑盒說明書配備雜交體系進行雜交，雜交程序設置見表2，雜交總時間約為1 h 40 min。

1.3.6芯片掃描及判讀雜交完畢，用上海百傲基因芯片掃描儀進行掃描，ALDH2判讀系統進行基因型判讀。芯片點陣見圖1(見《國際檢驗醫學雜志》網站“論文附件”)。

1.4統計學處理采用Excel統計軟件進行數據處理。

2結果

2.1基因組DNA電泳結果如圖2所示:提取的基因組DNA位于點樣孔附近，條帶完整、清晰、明亮，DNA質量好，1～5泳道均為樣本基因組DNA，見圖2(見《國際檢驗醫學雜志》網站“論文附件”)。

2.2PCR電泳結果ALDH2基因片段大小為438 bp，目標片段在250～500 bp之間，與目的片段大小吻合。1～5泳道均為PCR擴增產物。見圖3(見《國際檢驗醫學雜志》網站“論文附件”)。

表2　　雜交程序

2.3100例樣本各基因型比例100例檢測樣本中，共檢測出野生純合型(GG型)72例；雜合突變型(GA型)26例；突變純合型(AA型)2例。100例樣本中各基因型所占比例分布見表3。

表3　　100例體檢樣本各基因型比例

2.4ALDH2基因芯片檢測結果為驗證芯片結果的準確性，取部分樣本進行測序，ALDH2各基因型芯片掃描圖及對應測序圖，芯片檢測結果與測序結果吻合見圖4～6(見《國際檢驗醫學雜志》網站“論文附件”)。

3討論

人類ALDH2基因上共發現了84個單核苷酸多態性位點，其中在外顯子12處發生點突變(Glu487Lys)，谷氨酸Glu(密碼子GAA)變為賴氨酸Lys(密碼子AAA)，使正常的等位基因G，變為突變型等位基因A，導致該基因編碼的酶的催化能力下降[2]。因遺傳，在人群中該酶基因型出現3種情況，具有正常催化活性的純合子型：GG型；催化活性下降的雜合子型：GA型；催化活性失去的純合子型：AA型。乙醛脫氫酶是酒精代謝的關鍵酶。在肝臟內，乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)催化乙醇脫氫生成乙醛，乙醛進一步在 ALDH的催化下脫氫生成己酸，再經三羧酸循環途徑氧化生成二氧化碳和水排出體外[3]?；蛐虶A和AA者，因不具有ALDH酶活性或酶活性下降,飲酒后可使乙醛氧化為乙酸延遲。乙醛損傷肝細胞可引起纖維變性，影響能量代謝并產生自由基，導致酒精中毒性肝炎、脂肪肝、纖維變性及肝硬化等。ALDH2基因的作用除與酒精代謝相關外，另發現其與人類各系統及其他疾病間也密切相關。

有文獻報道ALDH2 是硝酸甘油(GTN)的有效代謝物一氧化氮 (NO)形成的關鍵[4]。試驗表明,ALDH2基因在硝酸甘油對肺部及循環系統血管床的生物轉化中發揮重要作用[5]，如果患者基因中攜帶有 ALDH2基因(Glu487Lys)突變,可使硝酸甘油在體內的生物轉化過程受阻,藥物難以有效發揮作用[6]。

另外，相關文獻報道，ALDH2是不依賴乙醇的心血管疾病的獨立影響因素，可通過減少活性氧簇(ROS)或解毒4-HNE途徑抑制乙醛或缺氧而至的心肌細胞凋亡，對心功能不全和心肌病起到保護作用[7]。ALDH2缺陷型是冠心病的危險因素[8]，ALDH2野生型伴隨著更高的高血壓風險[9]。由此可見，ALDH2基因突變對多系統多類型疾病存在不良影響，ALDH2基因型檢測，可了解是否為突變基因攜帶，對各系統疾病均具有重要的臨床指導意義。有利于對心血管病高危人群進行宣教，進行早期預防及干預；可指導硝酸甘油臨床用藥；以及在篩選酒精易感人群并采取有效的保護和干預措施等方面都具有潛在的應用價值。

本研究共檢測樣本100例，測出野生純合型(GG型)72例；雜合突變型(GA型)26例；突變純合型(AA型)2例。結合有關文獻報道，江春曉等[10]曾檢測231例樣本，測出野生型145例,突變型86例；曹西蓉等[11]檢測60例，測出(GG型)37例，(GA型)21例，(AA型)2例，提示ALDH2基因存在較高的突變率。

基因檢測方法多樣，目前線粒體ALDH2基因多態性檢測方法主要有：PCR產物限制性酶切片段長度多態性(PCR-RFLP)和直接測序法。PCR-RFLP法的缺點是測定時間長、PCR反應產生的氣溶膠極易對其他標本產生污染、不能進行自動化的分析、結果的判讀受到人為因素的影響等。測序法需要特殊的儀器和專門的操作人員，不適合在臨床實驗室應用[12]。本研究采用芯片檢測法，該方法由DNA提取、雜交儀雜交、芯片掃描幾個步驟組成,有以下幾個優點:(1)各試劑在雜交儀內自動完成雜交、洗滌，一份標本一張芯片，避免了人工操作的污染，并且有效節省工作時間；(2)掃描儀自動分析圖像，避免了人為判斷的誤差，相較傳統方法較高效準確；(3)基因組DNA及PCR擴增產物經電泳分析證實為ALDH2基因，經測序驗證，證實芯片檢測結果與測序結果吻合，表明芯片檢測結果可信；(4)實驗操作簡便，易于實驗人員掌握；(5)相較于傳統檢測方法，芯片法的出現表明現代化檢測技術在不斷優化成熟。綜上所述，表明芯片檢測法快捷、高效、準確、先進，能滿足臨床對ALDH2基因檢測的需求，是值得臨床推廣的一項新興基因檢測技術。本實驗的不足之處：本研究方法屬于臨床實驗性研究，樣本量尚小，且限制在體檢人群，下一步擬將擴大樣本量，納入臨床各系統疾病患者，進一步觀察ALDH2基因多態性芯片檢測法在臨床多系統疾病方面的指導意義。

參考文獻

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Gene chip method for detecting ALDH2 gene polymorphism among populations of healthy physical examination*

XuXiaojing1,QuHao2,ZhangHua1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofNeurology,GuizhouProvincial

People′sHospital,Guiyang,Guizhou550002,China)

Abstract:ObjectiveTo adopt the gene chip method to detect the ALDH2 gene polymorphism for evaluating the feasibility of this method used in clinical detection.Methods100 individuals undergoing the healthy physical examination were selected as the detection objects.The gene chip method was adopted to detect the genotype GG,GA and AA in 487 mutation loci of ALDH2 gene.Results72 cases of GG type,26 cases of GA and 2 cases of AA were detected out.ConclusionThe gene chip method could meet the requirements of clinical ALDH2 gene detection with better clinical application prospect.

Key words:aldehyde dehydrogenase 2 gene;gene chip

(收稿日期：2015-07-22)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.01.005

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)01-0011-03

*基金項目：貴州省科技廳社發與科技攻關項目(黔科合LS字[2011]011號)。

作者簡介：徐筱婧，女，初級檢驗技師，主要從事分子生物學研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail：780837482@qq.com。