延邊黃牛與韓延牛血液Exosome對延邊黃牛垂體細胞中GH含量的影響

關立增，婁安鋼，樸明淑，蔡錦順

(延邊大學農學院，吉林延吉 133002)

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延邊黃牛與韓延牛血液Exosome對延邊黃牛垂體細胞中GH含量的影響

關立增，婁安鋼，樸明淑，蔡錦順*

(延邊大學農學院，吉林延吉 133002)

延邊黃牛肉質細膩多汁，鮮美可口，品質優，特別是不飽和脂肪酸、必需氨基酸和風味氨基酸含量明顯高于其他品種牛，具有極高的產品發展價值，市場前景廣闊[1]。但是，延邊黃牛具有生長周期長、飼養成本高和出欄率低等缺點，已嚴重制約了延邊黃牛養殖業的發展[2]。因此，如何提高延邊黃牛的生長速度是加快延邊黃牛養殖業發展的關鍵問題之一。韓延牛與延邊黃牛的血統相近，而其生長發育速度、初生重及各年齡段體尺和體重均極顯著高于延邊黃牛[3]，因此研究二者之間在生長方面的差異將為提高延邊黃牛的生長速度提供新途徑。

Exosome(外胞體)是一類由多種細胞分泌的、直徑為30～150 nm并具有膜結構的小囊泡。研究表明，外胞體與動物生長有密切的關系[4]。Melnik等[5]研究發現牛乳中的Exosome可以促進犢牛的生長，垂體細胞中分泌的生長激素(Growth hormone，GH)是直接調控動物生長的重要內分泌激素。因此，關于Exosome通過影響GH分泌來調控動物生長的研究是提高動物生長速度的一個新的途徑。筆者選擇延邊黃牛和韓延牛為研究對象，研究延邊黃牛及韓延牛血液外胞體對延邊黃牛垂體細胞中GH的調控機制，以期為延邊黃牛生長調控提供新資料，也為提高延邊黃牛的生長發育速度奠定基礎。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器。JEM-1230EX透射電鏡(日本)；超高速冷凍離心機(美國Kemdro公司)；SHEL LAB 2406-2型CO2培養箱；ABI MX3000P型熒光定量PCR儀(ABI 美國)；凝膠成像系統(Ultro-Violet Products公司，英國)。

1.1.2試劑。Trizol Reagent(Invitrogen公司)；RNase固相清除劑(北京天澤基因公司)；DMEM/F-12、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、膠原酶 Ⅱ 及青霉素、鏈霉素，均購自GIBCO公司；M-MLV反轉錄酶、DNA Marker、dNTPs、Ribonuclease Inhibitor、DNase I、TaqDNA聚合酶，均購自TaKaRa公司；[125I]人生長激素放射免疫分析藥盒，購自天津九鼎醫學生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1延邊黃牛和韓延牛Exosome的提取。分別抽取4～6月齡斷乳延邊黃牛和韓延牛全血于50 mL離心管中，2 500 r/min離心5 min，取上清獲得血漿。將血漿置于超速離心管中，放入超速離心機，50 000 r/min離心60 min；棄上清，用0.01 mol/L PBS將沉淀吹下，使其溶解，再次將其置于超速離心管中，放入超速離心機，50 000 r/min離心60 min；棄上清，加入0.01 mol/L PBS溶液，使用移液器將沉淀反復吹打，使其完全混勻，即為Exosome溶液。然后，在透射電鏡下鑒定Exosome形態并拍照。

1.2.2延邊黃牛垂體細胞原代培養。在無菌條件下分離延邊黃牛垂體組織，分離垂體前葉棄去垂體后葉，在裝有500 μL 無Ca2+、Mg2+和PBS溶液的1.5 mL EP中剪碎至1 mm×1 mm組織塊，用pH 7.0的PBS沖洗3遍。然后，將組織沉淀轉移到培養瓶中，平均每個垂體加入0.5 mL 0.25%膠原酶、0.5 mL 0.25%胰蛋白酶，于37 ℃水浴搖床孵育消化25 min，最后用含10%胎牛血清的培養基終止消化。用100目細胞篩過濾細胞，將濾液于4 ℃、2 000 r/min離心10 min并棄上清，用DMEM/F12培養液懸浮細胞，放入75 mL培養瓶中于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞從組織塊中爬壁生長至80%時，用0.25%的膠原酶消化，并采用差速貼壁法分離細胞，獲得原代培養細胞。

1.2.3Exosome對延邊黃牛腺垂體細胞GH mRNA表達的影響。 用含10%胎牛血清的DMEM/F12對延邊黃牛垂體細胞進行培養，待細胞連接成片后吸棄培養基，用PBS沖洗細胞2次。加入2 mL DMEM/F12培養基預處理細胞4 h，然后用100 μL PBS(對照組)、100 μL延邊黃牛血液Exosome(100 ng/mL)和韓延牛血液Exosome(100 ng/mL)對細胞進行處理6 h，每個試驗組及對照組均設5個重復。處理結束后收集培養液，用PBS清洗細胞1次，并棄去廢液，收集細胞。

采用TRIzol Reagent 提取垂體細胞總RNA，整個過程在冰上操作，總RNA提取后用DNaseI消化以除去痕量DNA的污染。以獲得的總RNA為模板，用OligodT-18為引物，在M-MLV逆轉錄酶催化合成cDNA。使用Primer Premier 5.0軟件設計延邊黃牛GH基因及β-actin基因的上游引物和下游引物。β-actin的上、下游引物分別為：CCACGAAACTACCTTCAACTC和CCACGAAACTACCTTCAACTC；GH的上、下游引物分別為：CTCCAACTGGCTGCCGACAGCTA和CGATGTCTGCTGGGGCTCGTCC。

在優化反應參數后，進行熒光定量PCR檢測，具體反應體系為：SYBR Green Master Mix 10.0 μL，上、下游引物各 0.3 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 8.4 μL。將各成分加入到定量PCR板的各孔中，封膜、振蕩混勻，放入qRT-PCR儀中，反應條件為：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，40個循環并在延伸結束收集熒光信號；最后95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，繪制溶解曲線并收集熒光信號，每個樣品2個重復。GH基因mRNA表達水平采用2-ΔCt法進行計算，其計算公式為ΔCt=GH基因Ct-內參基因Ct。

1.2.4Exosome對延邊黃牛腺垂體細胞GH分泌的影響。用含10%胎牛血清的DMEM/F12對延邊黃牛垂體細胞進行培養，待細胞連接成片、鋪成單層后，吸棄培養基，并用預熱的PBS沖洗細胞3次；然后，用DMEM/F12培養基預處理細胞4 h；最后用100 μL PBS(對照組)、100 μL延邊黃牛血液Exosome(100 ng/mL)和韓延牛血液Exosome(100 ng/mL)對細胞進行處理，12、24和48 h后收集培養液，使用125I-GH放射免疫檢測試劑盒對細胞上清液中GH含量進行檢測。

1.2.5數據處理。試驗數據使用SPSS 17.0統計軟件進行統計與分析，結果均以平均值±標準誤表示。對不同處理組間的數值進行單因素方差分析(One-way ANOVA)及鄧肯氏多重比較(Duncan’s multiple range test)。P<0.05表示差異顯著。

2結果與分析

2.1延邊黃牛和韓延牛Exosome的觀察通過對延邊黃牛和韓延牛血漿進行一系列離心和超離心后分別獲得Exosome。從圖1可以看出，延邊黃牛和韓延牛血液中含有大量的Exosome，電鏡下觀察均呈圓形或橢圓形的雙層膜小囊泡，直徑也均為30～100 nm，膜結構完整。

注：A.延邊黃牛血液Exosome；B.韓延牛血液Exosome。Note：A.Blood Exosome from Yanbian yellow cattle；B.Blood Exosome from Hanyan cattle.圖1　延邊黃牛和韓延牛血液Exosome的透射電鏡圖(10 000×)Fig.1　Transmission electron microscopes of blood Exosome from Yanbian yellow cattle and Hanyan cattle

2.2Exosome對延邊黃牛腺垂體細胞GH mRNA表達的影響從圖2、3可以看出，韓延牛Exosome處理的延邊黃牛垂體細胞中GH mRNA表達顯著高于延邊黃牛Exosome處理組(P>0.05)。這表明韓延牛與延邊黃牛Exosome對延邊黃牛垂體細胞中GH的mRNA表達有明顯影響。

圖2　實時定量PCR檢測GH mRNA表達的電泳圖譜Fig.2　Electrophoretogram of GH mRNA expression by real-time quantitative PCR detection

圖3　韓延牛和延邊黃牛Exosome對延邊黃牛垂體細胞GH 的mRNA表達的影響Fig.3　Effects of Exosome from Yanbian yellow cattle and Hanyan cattle on mRNA expression of pituitary cells GH of Yanbian yellow cattle

2.3Exosome對延邊黃牛腺垂體細胞GH含量的影響用100 μL延邊黃牛血液Exosome(100 ng/mL)和韓延牛血液Exosome(100 ng/mL)對延邊黃牛垂體細胞進行處理12、24和48 h后，收集培養液并對細胞上清液中GH含量進行檢測。從圖4可以看出，韓延牛血液Exosome處理組的垂體中GH含量顯著高于延邊黃牛血液Exosome處理組。

圖4　延邊黃牛與韓延牛血液Exosome對延邊黃牛垂體細胞中GH含量的影響Fig.4　Effects of blood Exosome of Yanbian yellow cattle and Hanyan cattle on the GH content in pituitary cells of Yanbian yellow cattle

3討論與結論

延邊黃牛具有生產高檔牛肉的品質特性，而如何提高延邊黃牛的生長速度是人們關注的焦點之一。GH是一種具有種屬特異性的蛋白激素，可以促進骨、軟骨、肌肉及其他組織細胞分裂增殖，促進蛋白質合成，對動物生長發育起著重要的調控作用[6]。關于通過調控GH分泌來影響動物生長的研究是目前的熱點之一。研究表明，外胞體(Exosome)對動物的生長有調控作用[7]。筆者研究了延邊黃牛及韓延牛血液Exosome對延邊黃牛垂體細胞中GH表達的影響，可為提高延邊黃牛的生長速度提供一個新的途徑。

Exosome是一類由多種細胞分泌的、直徑為30～150 nm并具有膜結構的小囊泡，在透射電鏡下呈圓形或杯狀磷脂雙分子層結構[4，8]。該試驗中獲得的延邊黃牛與韓延牛的血液Exosome在電鏡觀察下均呈圓形或橢圓形的雙層膜小囊泡，直徑也均為30～100 nm，與以前報道結果相一致。

該試驗用100 μL PBS(對照組)、100 μL延邊黃牛血液Exosome(100 ng/mL)和韓延牛血液Exosome(100 ng/mL)對延邊黃牛垂體細胞進行處理6 h，通過實時熒光定量PCR檢測分析延邊黃牛垂體細胞中GH的表達。結果表明，韓延牛Exosome處理的延邊黃牛垂體細胞中GH mRNA表達顯著高于延邊黃牛Exosome處理的垂體細胞。這說明延邊黃牛血液Exosome抑制了延邊黃牛垂體細胞中GH的mRNA表達。為了進一步研究延邊黃牛和韓延牛血液Exosome對延邊黃牛垂體細胞中GH表達的影響，分別用延邊黃牛和韓延牛血液Exosome對延邊黃牛垂體細胞進行處理12、24和48 h后，收集培養液并對細胞上清液中GH含量進行檢測。結果表明，韓延牛血液Exosome處理組的垂體中GH的含量顯著高于延邊黃牛血液Exosome處理組。此結果也進一步證實延邊黃牛血液Exosome抑制了延邊黃牛垂體細胞中GH的表達，但具體抑制機制有待進一步研究。據推測，這可能與Exosome中含有的miRNAs有關[9]。Qi等[10]研究發現ssc-let-7c可調控豬GH的分泌，同時還預測let-7i、miR-34a、miR-136和miR-326可能與GH的分泌也存在著密切的關系。該研究可為進一步研究Exosome對延邊黃牛生長調控的分子機制提供理論基礎。

參考文獻

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摘要[目的]從延邊黃牛和韓延牛血液中分離Exosome(外胞體)，研究2種外胞體對延邊黃牛垂體細胞中GH含量的影響。[方法]通過超高速離心等方法，從延邊黃牛和韓延牛血液中分離Exosome，并以100 ng/mL的濃度分別轉染給原代培養的延邊黃牛垂體細胞培養12、24和48 h，對細胞上清液中GH含量進行檢測。[結果] 電鏡下延邊黃牛與韓延牛血液Exosome均呈圓形或橢圓形的雙層膜小囊泡，直徑均為30～100 nm，膜結構完整。韓延牛Exosome處理組的延邊黃牛垂體細胞GH mRNA表達顯著高于延邊黃牛Exosome處理組(P>0.05)。韓延牛血液Exosome處理組垂體中GH的含量顯著高于延邊黃牛血液Exosome處理組(P>0.05)。[結論]延邊黃牛和韓延牛血液中的Exosome對延邊黃牛垂體細胞中GH含量的影響有明顯差異。

關鍵詞延邊黃牛；韓延牛；血液Exosome；垂體細胞；GH

Effects of Blood Exosome in Yanbian Yellow Cattle and Hanyan Cattle on the GH Content in Pituitary Cells of Yanbian Yellow Cattle

GUAN Li-zeng, LOU An-gang, PIAO Ming-shu, CAI Jin-shun*(College of Agronomy, Yanbian University, Yanji, Jilin 133002)

Abstract[Objective] To study the effects of blood Exosome in Yanbian yellow cattle and Hanyan cattle on the GH content in pituitary cells of Yanbian yellow cattle. [Method] Exosome was isolated from Yanbian yellow cattle and Hanyan cattle by ultra high speed centrifugation method, and then was transfected to primary pituitary cell of Yanbian yellow cattle at a concentration of 100 ng/mL for 12, 24 and 48 h, respectively. Content of GH in cell supernatant was detected by kit. [Result] Electron microscope observation showed Exosomes from Yanbian cattle and Hanyan cattle blood were both a round or oval global double membrane vesicle. Their diameters were both 30-100 nm, and membrane structure was both complete. The expression of GH mRNA in the pituitary cells of Yanbian yellow cattle treated by Hanyan cattle Exosome was significantly higher than that treated by Yanbian yellow cattle Exosome(P>0.05).The content of GH in the pituitary of the Hanyan cattle group treated by blood Exosome was significantly higher than that of the Yanbian yellow cattle(P>0.05). [Conclusion] GH content in pituitary cells of Yanbian yellow cattle treated by blood Exosome of Yanbian yellow cattle shows significant differences with that treated by Hanyan cattle blood Exosome.

Key wordsYanbian yellow cattle; Hanyan cattle; Blood Exosome; Pituitary cells; GH

收稿日期2015-12-14

作者簡介關立增(1974- )，男，吉林延吉人，講師，博士，從事基因表達與調控研究。*通訊作者，副教授，博士，從事動物傳染病與預防研究。

中圖分類號S 811.2

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)01-105-03