水產品中氯霉素類藥物殘留檢測的衍生化條件

綦天華++張慧峰++楊揚++修磊++楊春橋++韓立中

氯霉素是一類具有廣譜抗菌作用的抗生素類藥物，應用在水產上可防治爛鰓和赤皮病等，但其對人類有很大的毒害作用，且代謝較慢，不易排出體外，目前被很多國家禁用，該藥殘留為我國申報無公害產品或進出口時的必檢項目，對于該藥的殘留目前主要通過氣相色譜法完成。但該法衍生化過程復雜，且可導致回收率偏低的因素較多。本文就衍生化中影響回收率的三個重要影響因素進行了系統分析，通過正交試驗法對其殘留量的衍生化條件進行了優化，得到了氯霉素殘留量衍生化的最優條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與設備 氣相色譜儀 Agilent 6890N（配63Ni電子捕獲檢測器）；旋轉蒸發儀 BUCHI R-215；離心機 上海安亭TDL-40B；漩渦混合器 德國IKA MS3 DS25；氮吹儀 航川奧盛 KD200。

1.1.2 試劑與藥品 氯霉素標準品含量99.5%（Sigma C-0378）；乙酸乙酯（色譜純） ；甲醇（色譜純） ；氯化鈉（分析純） ； 正己烷（色譜純） ；三氯甲烷（色譜純） ；乙腈（色譜純） ；硅烷化試劑：BSTFA + T CMS （99∶1） （美國Supelco 公司） ；固相萃取小柱（SPE） ： ENVI-18 （3 mL ，美國Supelco 公司）。

1.1.3 樣品及其制備 用于實驗的材料為淡水鯽魚，去鱗、皮，沿背脊取肌肉；樣品切為不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊后混勻，放置冰箱中冷凍貯存備用。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的制備 取氯霉素標準品0025 g，甲醇定容到50 mL，濃度為500 μg/mL，4 ℃冰箱中保存待用。臨用前取該貯備液，稀釋為0.100 μg/mL的標準工作液。

1.2.2 工作曲線的制備 取標準工作液，用甲醇稀釋，制備成濃度為0.1、0.5、20、50、100、200、500 μg/mL的標準使用液，分別置于5 mL玻璃離心管中，50 ℃干熱盡干，加入100 μL衍生化試劑，70 ℃恒溫加熱30 min，用氮氣吹干多余試劑，用0.5 mL正己烷溶解待用。測定峰高的響應值，以峰高值對質量濃度做工作曲線。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：DB-5石英毛細管柱，固定相：SE-54（聚甲基苯基乙烯基硅氧烷），30 m×0.53 mm×0.5 μm。載氣：氮氣，線速度29 cm/s，進樣口溫度：260 ℃。溫度程序：初始柱溫150 ℃，維持1 min，15 ℃/min升至260 ℃，維持10 min，然后設定30 ℃/min升至280 ℃，維持5 min，以確保所有的樣品已經流出。檢測器溫度：300 ℃。進樣方式及進樣量：無分流方式進樣，1 μL。檢測器：63Ni電子捕獲檢測器。

1.2.4 加標樣品的制備 取待測空白樣品5 g，加入濃度為0.100 μg/mL的標準溶液1 mL，各樣品作2個平行樣，根據公式計算得到加標濃度為20 μg/kg。

1.2.5 衍生化單因素實驗 將冰箱冷凍儲存的樣品室溫解凍，依據水產品行業標準[1]依次進行提取脫脂凈化，氮氣吹干得到干燥的殘留物。接下來進行衍生化的單因素實驗，具體單因素及水平見表1，具體操作步驟如下：向干的殘留物中加100 μL衍生化試劑，蓋塞并旋渦混合10 s，在70 ℃（55 ℃、70 ℃、85 ℃）烘箱中反應30 min（20 min、30 min、40 min）。再在50 ℃（35 ℃、50 ℃、65 ℃）砂浴中用氮氣流吹除多余的試劑，至樣品管剛好吹干為止。加入0.5 mL正己烷，旋渦混合10 s，供氣相色譜分析用。

2.2 衍生化溫度對氯霉素殘留加標回收率的影響

三個溫度下的氣相圖譜分別見下圖3、4、5，回收率結果見表2。

結論：通過根據外標法標準曲線，計算結果顯示衍生化溫度為60 ℃時回收率最高。

2.3 衍生化時間對氯霉素殘留加標回收率的影響

結論：通過根據外標法標準曲線，計算結果顯示衍生化時間為30 min時回收率最高。

2.4 衍生化砂浴溫度對氯霉素殘留加標回收率的影響

三個衍生化砂浴溫度下的氣相圖譜分別見下圖9、10、11，回收率結果見表4。

3 結論

正交試驗優化得到的最佳衍生化條件是：衍生化溫度60 ℃，衍生化時間30 min，砂浴溫度45 ℃。根絕R值計算結果可知，R1>R2>R3，所以衍生化溫度對于實驗結果的影響最大，砂浴溫度對于結果影響最小。優化得到的衍生化條件與行業標準相比略有不同。

參考文獻：

[1]

SC/T 3018-2004，水產品中氯霉素殘留量的測定[s].氣相色譜法，北京：中國農業出版社，2004.2

（收稿日期：2015-11-09）