毛蚶組織切片的制作和觀察

梁久征 王麗遠 龐寶成

摘 要：以毛蚶組織為試驗材料，使用蘇木精 — 伊紅染色法（HE染色法） ，對毛蚶組織結構進行固定、切片、染色。將制作的組織切片放在顯微鏡下，觀察其組織結構特點，探討貝類組織切片制作的各個技術要素。

關鍵詞：毛蚶組織；HE染色法；石蠟切片

HE染色法，是使用切片機把組織結構切成片層。選取的組織，經過固定、脫水、切片、染色等程序，然后，經過物理、化學的處理。在進行操作時，要注意根據不同性質的材料，選擇相對比較合理的方法進行處理。是生物學和組織學廣泛應用的染色法。切片法，能保障細胞與細胞在切片過程中，保持正常的組織關系，更好地保護組織細胞的原貌不被損壞，是光學顯微鏡的主要制片方法。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗材料

95%乙醇、中性樹膠、固體石蠟、氨水、雞蛋、甘油、冰醋酸、甲醛、鹽酸羥胺、蘇木素、伊紅、鉀明礬、活魚、苦味酸、水合氯醛、碘酸鈉、明礬、檸檬酸、肝素鈉、毛蚶（在市場購得）。

1.2 實驗儀器及設備

蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒、載玻片、蓋玻片、玻璃棒、瑞氏吉姆薩復合染液試劑盒、毛筆兩支、鑷子2個、電爐1個、洗衣粉、500 mL燒杯6個、染色缸20個、染色架5個、1 mL注射器2個、5 mL注射器2個、1 000 mL燒杯2個。

1.3 實驗所需試液的配制

1.3.1 福爾馬林溶液 甲醛10 mL、蒸餾水90 mL，配500 mL。

1.3.2 蘇木素[1]染液配制 蒸餾水 1 000 mL將碘酸鈉 0.2 g加熱到100 ℃后加入蘇木精 1 g，呈櫻桃紅色，然后加入硫酸鋁鉀 50 g，使其變成藍紫色，繼續加溫煮沸5 min后，加入50 g水合氯醛繼續攪拌，此時溶液應該為紅紫色，溶解完后加1 g檸檬酸，然后取下冷卻，此液可長期保存。若陳液水分蒸發可加適量2%鉀礬液稀釋[2]。

1.3.3 1%的伊紅溶液 稱取伊紅1 g，加100 mL蒸餾水溶解，用時加3滴冰醋酸。

1.3.4 70%，80%，90%酒精溶液 用無水乙醇分別與水比例為70∶30、80∶20、90∶10配制相應濃度的酒精溶液。

1.4 實驗操作

1.4.1 溶液配制 配制福爾馬林溶液，蘇木素染液，1%的伊紅溶液，70%、80%、90%酒精溶液待用。

1.4.2 制作血涂片 用5 mL注射器在鯽魚尾靜脈采取血液1 mL，再吸取2 mL肝素鈉抗凝血。在載玻片的一端滴一滴血液標本，推片與載玻片呈30～45°夾角，從血滴前端接觸血液并使血滴沿著推片均勻地散開，使血滴形成薄薄的一層血膜，然后在陰涼處風干。然后再做四個血涂片，其中第一個做空白對照，兩個用瑞士染液染色，兩個用吉姆薩染液染色。風干后清洗再晾干，最后在顯微鏡下觀察血細胞結構特點。

1.4.3 切片制作

1.4.3.1 玻片處理 在燒杯中加入適量水與洗衣粉，將新載玻片置于燒杯中，加熱煮沸15～20 min，小水流沖24 h，濾紙擦凈后使用。

1.4.3.2 取材 盡量取最新鮮組織，如有污物用水洗干凈然后濾紙吸干。一旦組織離開魚體，組織會以驚人的速度迅速固定，所以取新鮮組織來保證組織原本的形態學結構。

組織塊大小：斯頓伯格L.A指出，切片厚度的輕微變化，對組織化學定量結果的重復性產生極大的影響[3]。目前已有的確定組織切片厚度的方法，多以切片機標記的切片厚度作為切片的真實厚度；或者測量組織塊在切片過程中變薄的變化，推算組織切片的平均厚度[4]。所取組織體積1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm，以使固定液能迅速而均勻地滲入組織內部[5]。

取材部位：切片一定要把組織的結構特點全部顯示出來，材料的選取是關鍵。取材必須避免人為改變組織形態，取材刀剪鋒利，夾取時不要擠壓組織，組織固定以后，容易收縮，要將組織展平，從而顯示組織完整結構。取材對石蠟組織切片制作至關重要，把握好取材，也就成功了一半。取材部位為鰓、肝臟、腎臟、脾臟、腸。

1.4.3.3 固定與清洗 取不同組織，兩組用①②代表，分別置于紗布中包好，在固定液中固定24 h以上，然后取出各組織進行修塊，修塊大小為1 cm×1 cm×0.5 cm，修塊后再固定6～7 h。將之前固定好的組織紗布塊再放于大燒杯中，在燒杯口上蓋上紗布，并使燒杯略微傾斜，用小水流自來水沖洗24 h。

將組織放于固定液中，目的是防止細菌繁殖和酶作用使組織腐敗或自溶，使組織和細胞的固有形態、結構得以保存[6]。清洗的目的是洗掉固定液，同時沖洗也可以改變組織硬度，使切片制作變得簡單和更易于組織結構的觀察與分析。

1.4.3.4 脫水與透明 將組織分別移入70%酒精，80%酒精，90%酒精，95%酒精中，各個浸泡12 h，然后100%酒精①②各浸泡2 h，蘸干后再浸泡于無水酒精和二甲苯1∶1混合液10 min，二甲苯①②各20 min，使二甲苯將酒精替換出來。

1.4.3.5 浸蠟 提前8 h將石蠟放入60 ℃烘箱融化，反復兩次再用。在60 ℃烘箱中浸蠟，否則脆，浸蠟3 h。

1.4.3.6 包埋 把牛皮紙做成小紙盒并在小紙盒底部標注組織名稱，先將熔好的蠟倒入小紙盒中，再把浸蠟后的組織分別至于小紙盒中，石蠟凝固后組織被抱在其中，包埋后的組織可長久保存。

1.4.3.7 切片 視組織的大小，在靠近組織約0.1～0.2 cm的地方切掉多余的蠟，不然可能會容易使組織褶皺不平；把修好的蠟塊放置在金屬持蠟器上；把切片刀安裝在切片機的刀臺上，把刀臺上的緊固螺絲適當擰緊，使切片時比較穩定，從而能使切片厚度誤差減小；一般情況下石蠟切片的厚度保持在4～6μm；用鑷子小心地將切好的蠟帶輕輕平鋪在42 ℃的水面上，借水的溫度和張力，將略皺的蠟帶自然展平；待到切片在恒溫水面上充分展開后，將蠟片撈到載玻片的中間，然后傾斜載玻片使載玻片上的余水流失，再置于60～65 ℃烘箱內恒溫烤片3 h，使熔化在組織間隙的石蠟完全脫去，從而組織與玻片緊密結合。

1.4.3.8 染色和封片[7]

烘箱中取出的玻片先于二甲苯①②中各10 min，擦干后再移入酒精100%，95%，90%，80%，70%各2 min，蒸餾水2 min，然后移入蘇木素中染色8～9 min，取出擦干，在鹽酸酒精中放下去1秒然后拿出，反復3次，再用自來水小水流沖20 min。

沖洗后于伊紅中染色7～10 min，再分別于70%、80%、90%酒精中各洗3次，擦干后于95%酒精①②，100%酒精①②各5 min，二甲苯①②各10 min，最后用中性樹膠封片，1～2 d后顯微鏡觀察照相。

2 結果與分析

2.1 染色結果

毛蚶心臟血細胞染色情況（圖1）：細胞膜顯示為淡紅色，可以明顯地看出細胞核結構。染色不明顯。毛蚶血液中，含有淋巴樣細胞、巨噬細胞、白細胞和嗜堿性細胞等

圖1 毛蚶血涂片（瑞氏染色）

外套膜染色切片（圖2），染色較為明顯，顏色為紅色。可以明顯地看出分層結構。組織分為兩層，外面一層膜狀結構為淡黑色，規范地包圍著內部結構，起著很好的保護作用，內部呈現明顯的條紋狀、區分明顯。但是由于切片時不太規范，導致切片不太完整，所以看到的圖片也不完整，中間出現明顯的斷裂。

圖2 毛蚶外套膜肌肉組織40倍

圖3 毛蚶腸組織組織10倍

毛蚶腸組織的內表面形成皺襞，皺襞上含小腸絨毛，增加了消化食物、吸收營養的表面積。腸道染色不太明顯，但是可以看到明顯的組織結構。結構分明顯的兩層，外面一層壁狀結構，包圍著內部的觸角狀的結構，顏色淡紅。

2.2 總結分析

總體來說，本次實驗還算是成功的，因為染色結果比較明顯，毛蚶的組織結構區分、染色明顯。但是具體來說，此次實驗組存在很多不足之處，比如應該更加注意實驗操作的規范性。

在制作蠟塊和切片的時候，第一次切片制成的蠟帶十分不整齊，在重復了很多次之后，才真正地切除了蠟帶，這個過程，不能操之過急。還有就是對于實驗步驟的熟悉，以及每一個步驟時間的把握一定要準確，連貫，避免因為耽擱時間過長，導致實驗產生誤差。

參考文獻：

[1]

鄭偉.蘇木素染液中媒染劑用量的探討[J].解剖學雜志.2006，29（1）： 21-29

[2] 梅立新，張旭晨.蘇木素染液簡易配置法及應用[J].承德醫學院學報.1997，14（1）：59

[3] 斯頓伯格 LA.免疫細胞化學[M].北京：原子能出版社，1982.130

[4] Pakkenberg B，Guandersen HJG.Total number of neurons and glial cells in human brain nuclei estimated by the disector and the fractionator：J.Microsc，1988，150：1

[5] 龔志錦.病理組織制片和染色技術[M].上海：上海科學技術出版社，1994

[6] 王鳳龍.動物病理及檢驗技術[M].呼和浩特：內蒙古大學出版社，2006

[7] 劉明生，李川.雜交鱘幼魚爛鰓病、氣泡病組織病理學觀察[J].河北漁業.2012（3）：28-61