超濾管凈化/高效液相色譜-串聯質譜法測定動物源食品中喹諾酮類藥物殘留

鞠玲燕，宋曉華，谷　婕，徐成鋼，楊麗君

( 威海出入境檢驗檢疫局，山東　威海　264200)

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超濾管凈化/高效液相色譜-串聯質譜法測定動物源食品中喹諾酮類藥物殘留

鞠玲燕，宋曉華，谷婕，徐成鋼，楊麗君*

( 威海出入境檢驗檢疫局，山東威海264200)

喹諾酮類(Quinolones，QNs)藥物是一類抗菌作用強、抗菌譜廣的人工合成抗菌藥，廣泛應用于臨床診斷、動物疾病預防及促生長。QNs在動物源食品中的過量或不當使用會對食用者產生潛在“三致”(致癌、致畸、致突變)作用，誘導致病菌產生耐藥性，從而威脅人類健康[1]。因此，動物體內的QNs殘留問題備受關注，許多國家和組織都限制其使用并制訂出相應的最高殘留限量(MRLs)：美國禁止在食用動物養殖中使用氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones, FQNs)；日本批準使用的QNs僅有恩諾沙星、二氟沙星、奧比沙星、達氟沙星、馬波沙星、氧氟沙星和惡喹酸；歐盟規定動物肌肉、肝臟和腎臟中達氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星(環丙沙星與恩諾沙星量之和)、麻保沙星、沙拉沙星等的MRLs為0.01~1.9 mg；我國于2002年規定了環丙沙星、單諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、惡喹酸和氟甲喹等7種QNs藥物在動物肌肉組織中的最高殘留限量為10~500 μg/kg。因此，對動物源食品中QNs殘留量的檢測尤為重要。

目前QNs的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[2-3]、高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[4-5]、酶聯免疫法(ELISA)[6]等。其中HPLC-MS/MS法分析速度快、靈敏度高、選擇性和特異性好，是目前藥物殘留方面應用最普遍的檢測技術[7]。樣品前處理技術對于藥物的檢測至關重要[8]。QNs樣品前處理的常用方法有液液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)；LLE是凈化QNs的基本方法，但存在操作費時、消耗高純溶劑多以及樣品易乳化等不足[9-10]；SPE消耗溶劑少且不產生乳化現象，是QNs凈化最常用的方法[11-13]，但目前商品化的固相萃取柱一般只能一次性使用，成本較高。另外還有分子印跡固相萃取、基質固相分散萃取和超臨界流體萃取等較新的方法也被應用于QNs殘留分析，但均處于研究階段，技術尚不成熟[14-15]。

超濾(Ultrafiltration，UF)是一種加壓膜分離技術，其膜孔徑介于微濾和反滲透之間，通過膜表面的微孔結構對物質進行選擇性分離。即在一定壓力下，使小分子物質穿過一定孔徑的特制薄膜，而大分子物質不能透過，從而將小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術[16-18]。目前超濾技術較多應用于水處理工程，將其與HPLC-MS/MS結合應用于獸殘檢測的研究較少。本研究嘗試利用實用和快捷的超濾管凈化樣品，采用高效液相色譜-四極桿串聯質譜同時測定動物源食品中的10種喹諾酮類藥物殘留量，有效地消除了基質效應，方法靈敏度高、重復性好，適合于動物源食品中多種喹諾酮類藥物殘留的快速確證和定量測定。

1實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；API 4000串聯四極桿質譜儀(美國AB公司)；配有電噴霧離子源(ESI)；CR22GⅡ高速冷凍離心機(日立公司)；氮吹濃縮儀(美國Caliper公司)；MS3 旋渦混合器(IKA公司)。

乙腈(色譜純，美國默克公司)；甲酸、乙酸(色譜純，CNW公司)；無水硫酸鈉(分析純，天津市大茂化學試劑廠)：650 ℃灼燒4 h，置于干燥器中備用；1%乙酸酸化乙腈：99 mL乙腈中加入1 mL乙酸，混勻。標準品：恩諾沙星(ENR)、環丙沙星(CIP)、惡喹酸(OXO)、沙拉沙星(SAR)、雙氟沙星(DIF)、氟甲喹(FLU)、萘啶酸(NDL)、氧氟沙星(OFL)、諾氟沙星(NOR)、丹諾沙星(DAN)均購自Dr.Ehrenstorfer，純度≥97.2%。

超濾管：體積為50 mL，截留分子量(MWCO)：選用3 kD和10 kD，購自美國Millipore公司。新超濾管使用前加入超純水，水量完全過膜，冰浴或冰箱中預冷幾分鐘，將水倒出，然后加入前處理液。

1.2標準溶液的制備

用乙腈溶解標準品，配成濃度為100 mg/L的單標儲備液，于-18 ℃下儲存備用。使用時根據需要配成適宜濃度的混合標準中間液和標準工作液。

1.3液相色譜條件

色譜柱：Waters Xbridge C18(3.5 μm×2.1 mm×150 mm)；進樣量：20 μL；流動相：A為0.1%甲酸溶液；B為乙腈；流速：0.2 mL/min；梯度洗脫條件：0~1.0 min,80%A；1.0~6.0 min，80%~40%A;6.0~10.0 min，40%~20%A;10.0~14.0 min，20%A;14.0~14.1 min，20%~80%A;14.1~20.0 min，80%A。

1.4質譜條件

電噴霧電離源正離子掃描(ESI+)；多反應監測模式(MRM)；電噴霧電壓:5.0 kV；離子源溫度:500 ℃；霧化氣壓力(GS1):70 psi；輔助氣流速(GS2):55 psi；氣簾氣壓力(CUR):20 psi；碰撞室入口電壓(EP):10 V；碰撞室出口電壓(CXP):10 V。監測離子對、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)如表1所示。

表1　10種喹諾酮的優化質譜分析參數

*quantitative ion

1.5樣品前處理

準確稱取5.00 g粉碎好的樣品，加入20 mL 1%乙酸酸化乙腈，混勻，超聲20 min，加入5 g無水硫酸鈉，混勻，以8 000 r/min離心5 min，取12 mL左右上清液沿管壁慢慢加入超濾管中。離心機預冷至4 ℃，5 000 r/min離心10 min，準確移取離心出的液體10 mL用氮氣流吹干，以流動相定容至1.0 mL，供HPLC-MS/MS測定分析。

2結果與討論

2.1樣品前處理條件的比較

2.1.1超濾膜分子量的選擇通常情況下選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，MWCO不應大于目的蛋白分子量的1/3，若待測蛋白的分子量為10 kD左右，則可以用截留分子量3 kD的超濾管。而本實驗是需要離心透析出的液體，因此在選用超濾管時不但要考慮能否透析出目標化合物，還要考慮被截留的大分子物質在離心時是否會損壞超濾膜。10種喹諾酮類藥物的分子量均在200~400之間，根據現有的50 mL超濾管的型號規格(3，10，30，50，100 kD)，選用膜MWCO為3 kD和10 kD的超濾管進行試驗。

先加入10 mL 1%乙酸酸化乙腈離心10 min，3，10 kD超濾管均能全部濾出；選用豬肉和豬肝樣品，按“1.5”方法進行樣品處理后，取10 mL上清液加入超濾管中，5 000 r/min離心10 min，3，10 kD超濾膜均能夠離心徹底，且未見破損。為了更好地截留生物大分子物質，達到最佳凈化效果，本實驗選用截留分子量最小的3 kD超濾管。

2.1.2離心條件的選擇超濾管推薦的離心速率約為5 000 r/min。在空白樣品中添加10種喹諾酮類藥物混標(加標水平10.0 μg/kg)，加入20 mL 1%乙酸酸化乙腈，混勻，超聲20 min，加烘干的無水硫酸鈉5 g混勻，8 000 r/min離心5 min，取10 mL上清液加入超濾管中，分別對不同離心速率(3 000，4 000，5 000，6 000 r/min)和離心時間(5，10，15，20 min)進行比較，上機檢測后計算10種目標物的回收率。實驗結果顯示，離心速率對回收率無明顯影響，與離心出的液體快慢有關，即離心速率越大，達到相同凈化效果所需的離心時間越短，但離心速率過快，會損壞超濾膜，故在實際使用中采用 5 000 r/min離心10 min，其離心出的液體量滿足實驗要求且濾膜無破損。

2.1.3超濾管的凈化效果在空白牛肉樣品中添加10種喹諾酮藥物混標(加標水平為5.0 μg/kg)，加入20 mL 1%乙酸酸化乙腈提取后，取10 mL上清液加入超濾管中，進行凈化處理，離心液經氮吹后復溶，上機檢測；另取10 mL上清液直接氮吹復溶后檢測。經超濾管凈化處理和未處理的牛肉樣品的總離子流圖見圖1，由圖可以看出，經超濾管凈化處理的樣品干擾減少，降低了基質效應，達到了凈化目的。

2.2液相色譜條件的選擇

對比了以乙腈和0.1%甲酸、甲醇和0.1%甲酸、乙腈和水、甲醇和水作為流動相時對待測物質色譜分離的影響。結果顯示，流動相中加入0.1%甲酸可以提高待測物質的信號強度；采用甲醇和乙腈為流動相時，信號強度的差別不大，但采用甲醇時的基線噪音較大，因此選用乙腈作流動相。為了達到滿意的峰形和分離效果，采用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相進行梯度洗脫。在色譜柱的選擇中，比較了Agilent Zorbax SB-C18，XDB-C18和Waters Xbridge C183種色譜柱的分離效果，實驗最終選用分離效果最佳的Waters Xbridge C18色譜柱進行分離。

2.3質譜分析條件的優化

選擇ESI+模式，采用針泵進樣方式分別對分析物進行質譜條件優化，每種分析物選取豐度較高的3~4個碎片離子作為子離子，配制不同種類空白樣品基質標準溶液，剔除易受基質干擾的子離子。在MRM模式下優化各種質譜條件，最終選定的特征離子及優化的質譜分析參數見表2。10種喹諾酮添加水平為5.0 μg/kg的牛肉樣品的MRM譜圖見圖2。

2.4方法學驗證

2.4.1線性范圍、檢出限與定量下限按“1.5”方法制備不含待測組分的空白基質溶液，配制濃度分別為5.0，10.0，25.0，50.0，100.0 μg/kg的系列基質標準工作溶液，上機測定，以峰面積(y)對相應的喹諾酮濃度(x，μg/kg)繪制標準曲線。結果表明，在5.0~100 μg/kg(相當于樣品)濃度范圍內，10種喹諾酮的標準校正曲線線性關系良好，相關系數(r)均大于0.99。檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)采用向空白樣品中逐級降低加標濃度的方法來確定。以3倍信噪比(S/N=3)對應的目標物濃度作為檢出限，以S/N=10對應的目標物濃度作為定量下限。10種喹諾酮類藥物的LOD為0.15~0.75 μg/kg，LOQ為0.49~2.59 μg/kg(見表2)。

表2　10種喹諾酮的線性回歸方程、相關系數、檢出限與定量下限

2.4.2回收率與精密度選用不同基質(豬肝、牛肉、魚肉)的空白樣品，分別添加5.0,10,50 μg/kg 3個不同濃度水平的混合標準溶液，按“1.5”方法進行前處理，每個水平重復測定6次，計算其回收率和相對標準偏差(RSD)，結果見表3。測得平均回收率為71.4%~85.9%，RSD為3.9%~10.7%。該方法具有較好的回收率和重復性，可以滿足動物源性食品中10種喹諾酮類藥物殘留的日常檢測要求。

表3　豬肝、牛肉和魚肉中10種喹諾酮的平均回收率和相對標準偏差(n=6)

2.5實際樣品的測定

從市面上購得豬肝、牛肉、魚肉等10份以及本實驗室保留的陽性樣品3份，分別采用本方法和《GB/T 21312-2007 動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》進行檢測，10份市售樣品皆未檢出10種喹諾酮藥物殘留，3份陽性樣品中分別檢出恩諾沙星、環丙沙星和諾氟沙星，將對本方法陽性樣品的測定結果與國家標準方法的測定結果進行對比，測定值的相對偏差在±10%以內(見表4)，說明本方法的檢測結果準確可靠。

表4　陽性樣品中10種喹諾酮的檢測數據和相對偏差

*no detected

3結論

本研究通過優化超濾管體積、截留分子量、離心條件等參數，建立了超濾管凈化/高效液相色譜-串聯質譜法同時測定動物源食品中10種喹諾酮類藥物殘留的新方法。該方法采用超濾管凈化，凈化效果理想，能夠實現大分子物質與殘留目標物的有效分離。與傳統的液液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)相比，超濾管凈化技術簡便快捷、無需使用大量的有機溶劑，超濾透過的物質僅與分子量有關，與物質的其它性質無關，可去除任何樣品中的生物大分子物質(如蛋白質等)，有效降低樣品干擾，在復雜基質中的應用效果更明顯。本方法可擴展到其它獸藥殘留的檢測，為改進動物源食品中獸藥殘留檢測的前處理方法提供了新的契機。

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摘要：建立了超濾管凈化技術結合高效液相色譜-串聯質譜同時測定動物源食品中10種喹諾酮類藥物殘留的新方法。樣品經酸化乙腈提取后，采用50 mL Millipore超濾管(截留分子量3 kD)凈化，離心液氮吹復溶后，經Waters Xbridge C18色譜柱進行分離，以0.1%甲酸-乙腈作為流動相進行梯度洗脫，電噴霧正離子(ESI+)模式電離，多反應監測(MRM)模式檢測，外標法定量。結果表明，10種喹諾酮類藥物在5.0~100 μg/kg濃度范圍內線性關系良好，方法的檢出限為0.15~0.75 μg/kg，定量下限為0.49~2.59 μg/kg，在5.0,10,50 μg/kg 3個加標水平下的回收率為71.4%~85.9%，相對標準偏差(n=6)為3.9%~10.7%。方法簡便快速、靈敏度高、重復性好，可用于動物源食品中10種喹諾酮類藥物殘留的快速確證和定量分析。

關鍵詞：超濾管；高效液相色譜-串聯質譜；動物源食品；喹諾酮類藥物

Determination of Quinolones Residues in Animal-originated Foodstuffs by Ultrafiltration Tube Cleaning and High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryJU Ling-yan，SONG Xiao-hua，GU Jie，XU Cheng-gang，YANG Li-jun*

(Weihai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Weihai264200,China)

Abstract：A new method was established for the simultaneous determination of 10 quinolone(QN) residues in animal-originated foodstuffs by ultrafiltration tube cleaning with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS).After extraction with acetonitrile (containing 1%acetic acid),the extract was purified with 50 mL Millipore ultrafiltration tube (Molecular Weight Cut-Off，MWCO:3 kD),and then the centrifugal liquid was evaporated to dryness under a stream of nitrogen,and redissolved.The analytes were separated on a Waters Xbridge C18column using 0.1%formic acid-acetonitrile as mobile phase.The identification and quantification of 10 quinolone residues were carried out under positive electrospray ionization (ESI+) in multiple reaction monitoring (MRM) mode，the quantification analysis was performed by the external standard method.The calibration curves showed good linearities in the range of 5.0-100 μg/kg for all QNs.The limits of detection for all QNs were in the range of 0.15-0.75 μg/kg,and the limits of quantitation were 0.49-2.59 μg/kg.The recoveries of these analytes varied from 71.4%to 85.9%at spiked levels of 5.0,10,50 μg/kg,with relative standard deviations of 3.9%-10.7%.This method was simple,rapid,sensitive and reproducible,and could be applied in the determination of 10 quinolone residues in animal-originated foodstuffs．

Key words：ultrafiltration tube；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);animal-originated foodstuffs;quinolones

中圖分類號：O657.63；TQ460.72

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)01-0042-06

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.01.007

通訊作者：*楊麗君，碩士，高級工程師，研究方向：食品安全，Tel:0631-3807680，E-mail:18663136117@163.com

基金項目：國家質檢總局科技計劃項目(2013IK178)；質檢公益性行業科研專項(201310143)；國家科技支撐計劃項目(2012BAK08B01)

收稿日期：2015-07-01；修回日期：2015-07-31