PRF的制備及保存方法的研究進展

毛俊麗綜述，王　拓，孫勇審校，陳紅亮，趙　峰

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綜述.講座

PRF的制備及保存方法的研究進展

毛俊麗綜述，王拓，孫勇審校，陳紅亮，趙峰

富血小板纖維蛋白；制備；方法；保存

富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）由法國科學家Choukroun等于2001年首次提出，與第一代富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）相比，第二代富血小板制品因其簡化的制備和血液未經生化處理而得到廣泛應用。骨增量術中，將PRF與骨移植材料混合，可以提高移植材料的穩定性及骨誘導性，從而起到止血、促進創口愈合、加速骨再生及骨改建等作用；也可以制備成膜，便于臨床使用[1]。臨床試驗表明，富含生長因子的PRF混合骨移植材料應用于引導骨再生，可以提高成骨活性[1]。但PRF制作方法研究報道較多、較雜，保存方法尚無統一定論，本文就PRF的制作及保存方法做一綜述。

1　PRF的制備

1.1制備原理制備PRF要求收集血液至不添加抗凝劑的試管，快速離心。由于缺乏抗凝劑，血液接觸試管表面即開始凝結，因此為了成功制備PRF，快速血液收集和在凝血反應開始前直接離心是絕對必要的[1]。PRF制備過程同時進行著離心反應和凝集反應。離心作用即在離心機強大的離心力作用下，使血液中血細胞的沉降加快,把血液中不同沉降速率(基于粒子的大小、形狀和密度等決定）的物質分開,實現血液分層[2]；凝集反應類似于人體生理凝血過程，依賴血液樣本含有的少量凝血酶將纖維蛋白原緩慢轉化為纖維蛋白網狀結構，這種緩慢聚合過程更符合生理凝血機制，應用于臨床也會引起一個更高效的細胞遷移和擴散,促進軟硬組織愈合[3]。制備的PRF包括以下3層：上層貧血小板血漿(platelet-poor plasma，PPP)，中間層PRF凝膠，下層為紅細胞層[4]。

1.2離心方法PRF制備的關鍵是選擇離心方法，離心方法主要由相對離心力（relative centrifugal force，RCF）和離心時間決定。而相對離心力越大，離心時間越久，血液中細胞破壞可能性越大[5]。RCF被廣泛用來描述離心，它與轉速和離心半徑相關。RCF=1.118×10-6×R×W2(R為離心半徑，單位為cm；W為每分鐘轉速，單位為r/min）[6]。

最常用PRF的制取方法是Choukroun等[7]在2001年提出的，采集10 ml全血到不含抗凝劑的試管內，立即采用3000 r/min(相對離心力大約400×g)，離心10 min。 Shahram等[8]采用的標準PRF制備方法是：采集9m l全血到不含抗凝劑的無菌玻璃涂層的塑料管，以2700 r/min離心12min；改良型富血小板纖維蛋白（advance platelet-rich fibrin，APRF）的制備方法是：采集10ml全血到不含抗凝劑的無菌純玻璃管，以1500 r/min離心14min。PRF和APRF由于離心力的不同，特定的細胞類型構成不同。APRF應用于引導骨再生有可能成為一種理想的自體細胞供體，特別是中性粒細胞和巨噬細胞，各種細胞相互協作，促進傷口愈合和組織修復再生。程亞楠[2]分別采用2500 r/min（978×g)、3000 r/min（1408×g)、4000 r/min(2504×g)，離心10min，3種離心條件產物的纖維蛋白結構及細胞分布無明顯差異。前兩組的PRF中白細胞和血小板回收率及部分生長因子的釋放量雖高于第3組，但差異無統計學意義。李艷秋等[9]分別采用2500、3000、3000 r/min離心10 min和3000 r/min分別離心10、15、20min的6種方式制備PRF，測定每種產物在7 d內TGF-β和PDGF-AB釋放含量，結果3000 r/min離心10min釋放量明顯高于其他組。

1.3離心試管Mustafa等[10]用鈦試管3500 r/min離心15 min制備T-PRF(titanium-prepared，platelet-rich fibrin)。T-PRF的血小板聚集過程和玻璃管制備的PRF相似，因其不含二氧化硅，具有更好的生物相容性。作為一種新的富血小板制品，經過初步動物體內實驗，證實其在前15 d對于結締組織形成方面具有極強的誘導再生潛力。李龍等[11]采集家兔血液，分別用塑料管和玻璃管制備PRF膜片，對比觀察7個時間點VEGF的濃度變化，結果用塑料管制備的PRF比用玻璃管制備的釋放VEGF含量低。

1.4除水方式血液經離心后，除水的方式有兩種，一種方法是取出PRF凝膠靜置10 min（緩慢脫水）；另一種方法是將PRF放入到PRF專用工具盒內，壓制成膜或者塊（快速脫水）。李艷秋[9]等將制備的PRF分別用緩慢脫水和快速脫水兩種方式處理，結果發現其釋放生長因子的含量無明顯差異。生長因子及血小板鑲嵌在纖維蛋白構成的三維網狀結構中，擠壓并不會丟失。因此，目前臨床上常采用快速脫水的方式制備PRF。

2　保存方法

PRF作為一種源自自體的生物材料，臨床上多采用新鮮制備的，其保存方法研究較少，并且尚未見有特別理想的保存方法。孫悅[12]將單純利用冷凍干燥技術處理的PRF與新鮮PRF通過掃描電鏡、降解性檢測、對細胞增殖影響等方面進行對比觀察，發現凍干后的PRF結構疏松多孔，其內的纖維網狀已經消失，部分生長因子的釋放及降解速度加快，但其生長因子的活性并無影響。將PRF放在聚碳酸1,2-丙二酯和聚琥珀酸丁二酯的共聚物膜上凍干得到的復合膜，其生長因子的釋放及降解速度較新鮮PRF減緩，這種復合凍干膜還具有支架作用，有望成為PRF保存應用研究的新方向。為了研究PRF體外生長因子的釋放曲線，李龍等[11]將制備的PRF置于無菌DMEM培養基中，分別放置于4℃和37℃下培養，分別在7個時間點收集析出液，保存于-20℃，測定其VEGF濃度值，得出結論4℃比37℃培養條件下釋放VEGF含量高。

3　小結

PRF已廣泛應用于口腔頜面外科、口腔種植修復與牙周病等，目前大部分學者采用的人體PRF制作方法是：采集人體血液置于標準PRF無菌玻璃涂層的塑料離心管內（不添加抗凝劑），用德國PROCESS PC-02離心機，在3000 r/min即刻離心10 min或2700 r/min即刻離心12 min；取出PRF凝膠放入PRF制備工具盒，壓制成塊或者膜。雖有報道新方法制備的血小板衍生物，如APRF、TPRF具有某些方面發展潛力，但其仍有待進一步動物實驗及臨床研究。由于PRF制作方法較為簡單，其蘊含的生長因子在制作完成后1 h內大量釋放，以及沒有很好的保存方法[2]，故建議在制作后盡早使用。

[1]Sunitha Raja V,Munirathnam Naidu E.Platelet-rich fibrin: evolution of a second-generation platelet concentrate[J].Indian J Dent Res,2008,19(1):42-46.

[2]程亞楠.三種離心方法對L-PRF生物學特性的影響[D].長沙:中南大學,2013.

[3]Dohan DM,Choukroun J,Diss A,et al.Platelet-rich fibrin(PRF), a second-generation platelet concentrate.PartⅠ:technological concepts and evolution[J].Oral Surg OralMed Oral Pathol Oral Radiol Endod,2006,101(3):e37-44.

[4]Anilkumar K,Geetha A,Umasudhakar et al.Platelet-rich-fibrin: a novel root coverage approach[J].J Indian Soc Periodontol, 2009,13(1):50-54.

[5]彭玉蓮,張成,馮妙芙,等.離心力和離心時間對尿沉渣中紅細胞和白細胞成分的影響[J].國際檢驗醫學雜志,2011,32(8): 869-870.

[6]冷懷明,范華隸,張大春.正確表示相對離心力的量和單位符號的探討[J].編輯學報,2003,15(4):269.

[7]Choukroun J,Adda F,Schoefflr C,et al.Une opportunitéen paro-implantologie:le PRF[J].Implantodontie,2001,42:55-62.

[8]Shahram Ghanaati,Patrick Booms,Joseph Choukroun.Advanced platelet-rich fibrin(A-PRF)-A new concept for cell-based tissue engineering by means of inflammatory cells[J].JOral Implantol, 2014,40(6):679-689.

[9]李艷秋,周延民,孫曉琳.富血小板纖維蛋白體外釋放TGF-β和PDGF-AB影響因素的探討[J].現代口腔醫學雜志,2012, 26(6):404-407.

[10]Mustafa Tunali,Hakan?zdemir.In vivo evaluation of titanium-prepared platelet-rich fibrin(T-PRF):a new platelet concentrate[J].British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 2013,51:438-443.

[11]李龍,趙建輝,劉斌,等.富血小板纖維蛋白體外釋放VEGF影響因素的探討[J].中國美容醫學,2012,3(21):427-430.

[12]孫悅.PPC/PBS與PRF以凍干法復合后的基礎及應用研究[D].長春:吉林大學,2013.

R 783.9

A

1004-0188（2016）03-0326-02

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.03.038

全軍“十二五”科研面上課題（CWS11J024）

646000四川瀘州，四川醫科大學口腔醫學院（毛俊麗，王拓）；成都軍區機關醫院口腔科(孫勇，陳紅亮，趙峰)

孫勇,E-mail:2623457656@qq.com

（2015-12-23）