循環腫瘤細胞在肺癌診斷中的研究進展

黃 璜綜述，陳 虹審校（重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科，重慶400016）

循環腫瘤細胞在肺癌診斷中的研究進展

黃 璜綜述，陳 虹△審校
（重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科，重慶400016）

肺腫瘤/診斷； 血液循環； 早期診斷； 預后； 綜述

肺癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，發病率及死亡率在惡性腫瘤中均位居前列［1-2］，約40%的肺癌患者在初診時即合并遠處轉移［3］，從而嚴重影響肺癌患者預后。目前肺癌診斷方法（包括篩查血清腫瘤標志物、影像學檢查、病理活檢等）的安全性、準確性等不盡如人意。因此，新型肺癌診斷方法的探索存在需要的臨床意義。循環腫瘤細胞（CTCs）作為“液體活檢”，有助于肺癌診斷，可能成為未來肺癌診斷的重要方法。本文主要對CTCs在肺癌診斷中的研究進展作一綜述。

1 肺癌診斷現狀

肺癌是世界范圍內癌癥相關性死亡的主要原因，每年有大約 1 800萬新發病例，5年生存率大概為15%［4-5］。目前有研究表明，未發生轉移的早、中期肺癌患者的5年生存率約為發生轉移者的13倍［6］，且早期肺癌患者有接受手術的機會，從而可提高肺癌患者的5年生存率［7］，故肺癌的早期診斷對于改善肺癌患者預后尤為重要。

肺癌的診斷方法包括篩查血清腫瘤標志物、影像學檢查及病理活檢。就目前已經廣泛應用的肺癌腫瘤標志物來說，包括癌胚抗原、細胞角蛋白片段抗原21-1、鱗狀細胞癌抗原及特異性烯醇化酶等，其敏感性及特異性仍遠遠低于理想值［8-9］。而影像學檢查主要評估腫瘤位置及大小，不能良好地反映肺癌的惡性程度及侵襲能力［10］。病理活檢是目前肺癌診斷的“金標準”，但病理活檢作為一項有創操作，可能出現出血、氣胸等并發癥，同時由于各種限制，結果可能為陰性［11］。這些均導致了病理活檢的應用低于臨床期望值，制約了病理活檢的發展。從而臨床上迫切需要具備高敏感性和特異性的腫瘤標志物應用于肺癌診斷或篩查，補足目前診斷方法的缺陷。

2 CTCs的檢測方法

2.1 CTCs概述 CTCs是指由原發腫瘤或轉移灶上脫落下來進入血液循環的腫瘤細胞，其脫落的關鍵機制包括腫瘤對血管的內滲作用及腫瘤相關脈管系統軟化使細胞被動脫落。CTCs具有與腫瘤原發灶一致的細胞學和遺傳學特征，且在早期腫瘤甚至癌前病變患者的外周血中即可檢測到CTCs。因此，CTCs作為“液體活檢”在肺癌診斷中存在極大價值［12］。CTCs的臨床應用對于肺癌的準確診斷提供了一種無創性的新型診斷方法，在肺癌的早期診斷中具有重要的臨床意義。

CTCs在血液中的含量極少（1/106～1/107），因此為了將檢測CTCs的敏感性提高到滿意程度，富集技術便顯得尤為重要。目前的富集方法包括使用免疫分離方法選取帶有腫瘤特異性標記的靶細胞，以及根據形態標準選取相應細胞。CTCs經過富集技術濃縮后，即可通過細胞計數或反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）等方法進行檢測［13］。

2.2 富集技術 CTCs富集技術主要通過辨別細胞形態特征所完成，該方法使用免疫磁珠（陰性富集或陽性富集）及通過微流體進行免疫分離：（1）基于形態學的富集技術。對大于白細胞（＞8 μm）的細胞進行過濾，但目前鮮有研究證實所有的CTCs均大于8μm，故此種方法尚缺乏說服力［14］。（2）免疫磁珠。免疫磁性分選系統是用于捕獲由磁珠所標記細胞的專門工具，通過細胞膜或細胞內染色達到目的，其后續步驟為透化及固定。例如CD326，其是參與細胞黏附的細胞表面分子，在大多數上皮癌中呈高度表達，以及腫瘤細胞抗原表皮生長因子受體2均可與用單克隆抗體所包被的磁珠結合，從而使CTCs的富集順利進行［15］。（3）干細胞技術。干細胞技術是一種陰性富集技術，其原理為CD45+細胞和多個紅細胞通過雙特異性四聚體抗體復合物交叉結合成細胞團，隨著這類非檢測需要的細胞密度增加，密度梯度離心后，CD陽性的細胞聚集在下層，而CD陰性的單核細胞則被隔離在介質和等離子體之間，從而達到富集目的［16］。

2.3 細胞計數法 細胞計數法基于抗原表達的原理分離和計數單個細胞，其中作用于特異性上皮抗原的單克隆抗體得到廣泛應用。與核酸檢測法比較，細胞計數法可保持細胞的完整性，從而可更加深入地描述CTCs，同時以便進一步對CTCs進行形態及分子鑒別。但是細胞計數法的主要特點是當前特異性抗體的缺乏，但這個問題可通過對CD45進行復染彌補一部分。在提高敏感性和特異性方面，則可通過多標志物的應用來處理，這能夠在一定程度上克服由于腫瘤的異質性帶來的檢測難題［17］。

2.4 核酸檢測法 CTCs也可通過檢測具有特定基因序列的腫瘤細胞來測定，如原癌基因或腫瘤抑制基因的DNA突變、致癌病毒序列的檢測均可用于CTCs的鑒定。但由于DNA的變異僅僅發生在發育異常的病變或成熟的腫瘤中，故循環游離DNA可能僅僅反映了核酸的存在，而非腫瘤細胞的存在，故目前檢測游離DNA并未用于臨床實踐。在臨床實踐中，更多使用的是通過檢測mRNA來反映CTCs的存在，常用方法包括PCR、RT-PCR等。有研究表明，RT-PCR的敏感性優于免疫細胞化學，但遺憾的是，該研究無對照組的數據［18］。其中定量RT-PCR增加了正常細胞和腫瘤細胞的mRNA區分度的表達，但與細胞計數法相似，RT-PCR也存在缺少特異性組織標記的問題。由于正常細胞的標記有時難以與腫瘤細胞的標記相區分，導致核酸檢測法具有較高的敏感性，但特異性卻難以達到令人滿意的程度，同時核酸檢測法操作相對復雜，易受污染，應用也受到限制。

2.5 CellSearch系統 該系統是目前美國食品藥物管理局唯一批準的CTCs檢測方法。CellSearch系統是一種將富集和檢測結合起來的半自動技術，分析檢測的快速性及樣本的可回收性是CellSearch系統的一大特色。CellSearch的檢測原理是因為來源于中胚層的白細胞可表達CD45，而來源于外胚層的腫瘤細胞表達細胞角蛋白（CK）及上皮細胞黏附分子（EpCAM），但不表達CD45，故在富集過程中，采用CK和苯基吲哚（DAPI）進行熒光染色，造血細胞則由CD45進行對比染色，然后使用自動熒光顯微鏡篩選出EpCAM+/CK+/DAPI+/ CD45-的細胞，可將其界定為CTCs。國外有研究者證實，在使用CK、EpCAM及DAPI標記時，特異度可達100%［19］，但該項研究樣本數較少，故CellSearch系統的在檢測CTCs中的敏感性和特異性可能需要更多研究證實。

2.6 CTC-chip法 該法與CellSearch系統原理基本相同，在芯片上約有78 000個顯微位點，每一個顯微位點均包埋有EpCAM抗體，當檢測樣本通過芯片時，CTCs即可被位點捕獲，該方法以CKs和DAPI為陽性，以CD45為陰性為標準［20］，從目前研究來看，CTC-chip具有更高的敏感性，可在1 mL血液中檢測出CTCs，其分離純度約為CellSearch的100倍，但因其局限于使用EpCAM檢測CTCs，故CTC-chip法在應用過程中可能出現假陽性［21］。

2.7 酶聯免疫斑點法（ELISPOT） ELISPOT可使用黏蛋白-1和CK19作為標記，去除CD45+的細胞，富集得到腫瘤轉移相關蛋白（CXCR4）陽性的細胞，檢測CTCs釋放的特定蛋白質，因此可取得較高的敏感性和特異性［22］。目前還不存在CTCs檢測的“金標準”，仍需通過不斷努力研究提高上述方法的可靠性。

3 CTCs在肺癌診斷中的價值

肺癌的早期診斷對于選擇治療方式及提高肺癌患者的5年生存率至關重要，是改善肺癌預后的關鍵步驟之一。目前國內外針對CTCs在肺癌中的診斷價值都進行了較多的研究。有研究結果顯示，CTCs在肺癌診斷中的敏感性為30.4%～89.0%，特異性為84.1%～100.0%［23-27］。其中Lou等［24］和Yu等［27］在2013年均設計了以PCR檢測CTCs的研究，設計的臨界值分別為8.64 CTCs單位及8.5 CTCs單位，對共計225例非小細胞肺癌患者進行了診斷，結果顯示敏感度分別為73.20%和81.80%，特異度分別為84.10%和93.20%，其中Yu等［27］報道的曲線下面積（AUC）為0.823。Chen等［23］則在2014年應用熒光原位雜交技術（FISH）對50例非小細胞肺癌患者外血清內的CTCs進行了檢測，臨界值為每3.2毫升2個細胞單位，敏感度和特異度分別為84.00%、97.60%。而Fiorelli等［25］在2015年設計了以免疫組織化學為檢測方法的相關研究，限定臨界值為CTCs計數大于25個，對60例平均年齡為65.5歲的肺癌患者進行了CTCs篩查，得到的敏感度和特異度分別為89.00%、100.00%。上述4項研究均顯示，CTCs具有較好的敏感性及特異性，但Tanaka等［26］于2009年報道的CTCs在肺癌中的應用數據顯示（臨界值為CTCs計數大于1個），125例肺癌患者中，真陽性、假陽性、真陰性及假陰性患者分別為38、3、22、87例，從而得到敏感度和特異度分別為30.40%、88.00%，AUC為0.598。

上述研究結果提示，CTCs在肺癌診斷的應用中雖具備較好的敏感性及特異性，但可能存在不足：（1）不同研究樣本數的影響，在5篇文獻中，樣本數均偏小，可能是造成其敏感性波動范圍較大的原因［23-27］；（2）研究對象中肺癌不同病理類型對于診斷結果的影響，如Lou等［24］和 Yu等［27］所報道的肺癌類型為非小細胞肺癌，其敏感性及特異性相對接近；（3）CTCs檢測方法的不同，在上述文獻中，其檢測方法包括PCR、FISH、免疫細胞化學等，在進行CTCs檢測時即可出現誤差；（4）不同研究者對于臨界值定義的不同，5位研究者其研究設計的臨界值分別為8.64、2、8.5、25、1個CTCs單位，而臨界值的設定直接關系到敏感性和特異性的計算，由此可見，在目前研究中，臨界值差異可能是造成誤差的主要原因之一；（5）納入的肺癌患者分期的不同，目前研究表明，不同分期的肺癌可造成外周血中CTCs計數的不同，故在比較過程中，亞組分析是關鍵的一步，但Chen等［23］及 Fiorellli等［25］并未進行亞組分析。因此為確定CTCs在肺癌診斷中是否存在較大優勢，可能需要更多、大型、前瞻性的研究證實。

綜上所述，作為潛在的新型肺癌腫瘤標志物，CTCs具有較好的敏感性及特異性，是一種快速、無創的診斷方法，因此CTCs是一種有潛力的外周血腫瘤標志物，但仍需更多的研究評估其臨床意義，從而指導臨床應用。

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