一種人血白蛋白和聚乙二醇衍生物水凝膠的制備與性能研究

李丹，汪偉，祝文斌，林高品浙江省杭州市亞慧生物科技有限公司，浙江杭州　310052

一種人血白蛋白和聚乙二醇衍生物水凝膠的制備與性能研究

李丹，汪偉，祝文斌，林高品
浙江省杭州市亞慧生物科技有限公司，浙江杭州310052

目的以人血白蛋白和聚乙二醇衍生物為主要成份構建了外科手術封合劑水凝膠。方法抽取該院2015年8月—2016年5月收集的人血白蛋白/聚乙二醇衍生物水凝膠在5 d后即能降解60%，在12 d時僅殘余少量水凝膠，具有良好的生物降解性。脹破強度試驗結果顯示聚人血白蛋白/聚乙二醇衍生物水凝膠的脹破強度（16.5± 4.1）kPa顯著高于外用凍干人纖維蛋白粘合劑（1.3±1.0）kPa。結果L929細胞在人血白蛋白/聚乙二醇衍生物凝膠浸提液中形態正常，MTT檢測表明人血白蛋白/聚乙二醇衍生物水凝膠無潛在的細胞毒性。 結論聚乙二醇衍生物和人血白蛋白凝膠具有凝膠速度快、脹破強度高、組織粘附性好和細胞毒性低的特點，人血白蛋白/聚乙二醇衍生物水凝膠為肺部外科手術后封合提供了一種新的選擇。

白蛋白；聚乙二醇衍生物；水凝膠；封合劑

［Abstract］Objective to establish a surgical sealant based on the Human Albumin and polyethylene glycol derivatives as the main components.Methods From August 2015 to May 2016 the Human Albumin/PEG derivative hydrogel was able to degrade 60%after 5 d，with only a small amount of hydrogel in 12 d，which had good biodegradability.The bursting strength test results showed that the bursting strength（16.5+4.1）kPa was significantly higher than that of the freeze-dried human fibrin adhesive（1.3±1.0）kPa.Results The morphology of L929 cells was normal in the gel extract of Human Albumin/，and the MTT test showed that there was no potential cytotoxicity of the.Conclusion Poly（ethylene glycol）derivatives and human serum albumin gel with gel speed，bursting strength high，tissue adhesion and low cytotoxicity，human serum albumin/polyethylene glycol derivative hydrogels after lung surgery letter provided the a new selection add Conclusion.

［Key words］Albumin，Polyethylene glycol derivatives，Hydrogel，Sealing agent

肺部手術后漏氣是肺切除和胸膜剝脫術等胸部手術后常見并發癥［1］。漏氣可能會引起嚴重的并發癥，包括支氣管胸膜瘺、延長胸腔引流置管時間引起的感染、延長恢復時間和增加住院費用等。纖維蛋白膠、氰基丙烯酸酯、GRF（甲醛交聯的明膠-間苯二酚）、GR FG（戊二醛和甲醛交聯的明膠-間苯二酚）等材料已經用于外科手術封合或止血，也被用于肺部手術后防止漏氣，但是效果并不明顯。聚乙二醇在藥物修飾、藥物載體、生物材料表面修飾以及水凝膠領域都有廣泛的研究與應用。基于人血白蛋白和聚乙二醇衍生物（聚乙二醇二琥珀酰亞胺琥珀酸酯，PEG-SS2）開發了一種新型外科手術封合凝膠，并對該凝膠作為肺部外科手術封合劑的可能性做了初步探索。

1　試驗

1.1試劑與儀器

PEG-SS2購于北京凱正生物工程發展有限責任公司。人血清白蛋白（25%）購于奧地利奧克特琺瑪藥劑生產有限公司。外用凍干人纖維蛋白粘合劑購于上海萊士血液制品股份有限公司。風干腸衣為市售。UV-5300型紫外可見光分光光度計，脹破強度檢測采用自制設備。

1.2試驗過程

1.2.1凝膠時間檢測采用試管翻轉法檢測凝膠時間。將聚乙二醇衍生物溶于緩沖液，分別配置成50、100、200 mg/mL和400 mg/mL的溶液。0.5 mL的人血清白蛋白溶液與0.5 mL的聚乙二醇衍生物溶液在1.5 mL離心管中混合。混合后開始計時，每隔5 S翻轉離心管，直至離心管內液體不能流動，此時的時間即為凝膠時間。

1.2.2溶脹性能檢測將1 mL人血清白蛋白溶液與1 mL聚乙二醇衍生物溶液混合后，澆注到長25 mm× 寬25 mm×深3 mm的模板中，形成凝膠后，取一定質量（W0）的凝膠放入離心管中，按照1 g/10 mL浸泡在0.1 M的PBS，在37℃水浴中孵化4 h。取出凝膠，用濾紙吸干表面水份后稱重，稱量其質量為W1，凝膠溶脹度計算公式為：溶脹度=（W1-W0）/W0×100%。

1.2.3體外降解 將1 mL人血白蛋白溶液與1 mL聚乙二醇衍生物溶液混合后，噴涂到長25 mm×寬25 mm× 深3 mm的模板中，形成凝膠后，取一定重量的人血白蛋白/聚乙二醇衍生物水凝膠，置于聚四氟乙烯板上，冷凍干燥至恒重（W0），將凍干后的凝膠放入離心管中，按照1 g/10 mL的比例浸泡在0.1 M PBS水中，在37℃水浴中孵化。每隔24 h取出凝膠，冷凍干燥后稱重（Wt），記錄凝膠的質量變化，凝膠的重量保持率=Wt/W0×100%。

1.2.4細胞毒性 細胞毒性試驗是用體外細胞培養方法進行毒理學風險評價。該次試驗是按國際標準ISO 10993.5-2009《醫療器械生物學評價第5部分：體外細胞毒性試驗》的MTT法進行的。無菌條件下，將所有溶液分別用0.22 μm濾頭過濾除菌；將水凝膠按照1 g/10 mL的比例浸提于MEM培養液中，置于37℃、5%CO2、濕度為100%的恒溫培養箱中孵化24 h，得到浸提液。在此次試驗條件下，該外科手術封合劑100%試驗液為試驗組1，50%試驗液為試驗組2，25%試驗液為試驗組3，12.5%試驗液為試驗組4。陽性對照為10%DMSO溶液。陰性對照為高密度聚乙烯按每0.2 g陰性對照加1 mL細胞培養基的比例，在60 rpm條件下（37±1）℃，浸提（24±2）h。介質對照為不含試驗液的細胞培養基，處理同試驗組。將樣品試驗液，陰性對照、陽性對照的浸提液及介質對照分別放于6個培養著L929小鼠成纖維細胞的細胞培養板孔內，在5% CO2，37℃細胞培養箱中培養，24 h后顯微鏡下觀察試驗樣品組、陰性對照組、陽性對照組及介質對照組培養后的細胞形態學改變，并用MTT法測定各供試品組（樣品組、陰性對照組、陽性對照組）相對于介質對照組的細胞存活率。

2　結果與討論

2.1凝膠時間

外科手術封合凝膠前體溶液，噴涂到在體內形成凝膠，如果凝膠化時間過快，有可能還沒完全注射入體內，就形成凝膠，不利于臨床操作；如果凝膠化時間過長，注射入體內后會在組織創面流動，甚至可能被體液稀釋，無法凝膠。聚乙二醇衍生物PEG-SS2與人血白蛋白溶液混合后，PEG-SS2活化端基和人血白蛋白組分自由氨基形成酰胺鍵，交聯形成水凝膠。交聯劑濃度增加，凝膠速度增加。PEG-SS2濃度為25mg/mL時，90 S以后未形成凝膠，溶液變粘稠；PEG-SS2濃度為50mg/mL時，凝膠時間為50 s；PEG-SS2濃度為100 mg/mL時，凝膠時間為20 s；PEG-SS2濃度為200 mg/mL時，凝膠時間為15 s；PEG-SS2濃度為400 mg/mL時，凝膠時間為15 s。交聯劑PEG-SS2濃度由25 mg/mL增加到100 mg/mL，PEG-SS2活性端基濃度也越高，凝膠時間越短。PEG-SS2濃度達到200 mg/mL，凝膠時間變化不明顯，在此后的研究中，PEG-SS2濃度設定為200 mg/mL。

2.2溶脹性能

溶脹性是指凝膠吸收液體后自身體積明顯增大的現象，是表征生物材料吸水性能比較簡單的方法［2］。該研究采用凝膠吸水后的質量變化百分比來反應凝膠的溶脹性能。凝膠吸水后質量增加。隨著凝膠前體溶液中PEG-SS2的濃度增加，溶脹比呈減少趨勢，由50 mg/mL的196%降低到400 mg/mL的65%，可能的原因是高濃度交聯劑條件下形成了更多的交聯點，限制了凝膠的溶脹。

2.3粘彈性

從粘彈性檢測結果可以看出，PEG-SS2濃度為200 mg/mL時，凝膠儲能模量G'和損耗模量G''分別約為12 300 Pa和50 Pa。人血白蛋白和PEG-SS2混合5 min后，水凝膠模量在檢測時間內變化不大，表明反應已經充分。

2.4顯微結構

水凝膠內部存在多孔結構。水凝膠的這種多孔結構為水分子的進出提供了路徑，允許水溶性物質如養分、代謝物通過，有利于組織創面的修復與再生。

2.5體外降解

體外水解，水凝膠在6 d后降解比例超過60%，在12 d時僅殘余少量水凝膠。證明水凝膠具有良好的生物降解性。

2.6細胞毒性

培養24 h后，在倒置相差顯微鏡下觀察L929細胞形態。結果表明，水凝膠浸提液各試驗組3細胞形態正常，貼壁生長良好，細胞基本上呈梭性或不規則三角形，與正常細胞形態相似。與介質對照組相比，試驗組1的細胞存活率為98%，試驗組2的細胞存活率為99%，試驗組的細胞存活率為%%，試驗組4的細胞存活率為96%。因此，在此次試驗條件下，該外科手術封合劑100%試驗液無潛在的細胞毒性［3］。

2.7脹破強度

脹破強度是外科手術封合劑重要指標之一，脹破強度以及凝膠破壞方式可以反應凝膠在組織表面的粘附性以及凝膠本體強度。Gonotti等在一項多中心的前瞻性隨機試驗中研究了肺部手術切除后纖維蛋白膠封合能力，發現纖維蛋白膠能夠顯著降低肺部手術后氣體漏氣持續時間。Moser等在一項前瞻性的隨機試驗中，研究了肺減容手術中使用纖維蛋白膠對于氣體漏氣時間和置管引流時間的影響［4］，發現使用纖維蛋白膠后持續漏氣時間和留置引流時間都顯著降低，22例使用纖維蛋白膠的病人僅1例發生術后持續性漏氣［5-10］，而22例對照組病人有7例發生術后持續性漏氣，胸腔置管引流時間分別為（2.83± 1.96）d和（5.88±2.96）d。白蛋白/聚乙二醇衍生物水凝膠脹破強度為16.5 kPa，顯著高于纖維蛋白膠脹破強度（1.3 kPa）。

3　結語

基于聚乙二醇衍生物和人血白蛋白凝膠具有凝膠速度快、脹破強度高、組織粘附性好和細胞毒性低的特點，該水凝膠有望用于肺部手術后漏氣封合。

［1］周虹，王華光，劉麗宏，等.468例人血白蛋白臨床應用調查與分析［J］.中國藥物應用與監測，2014（5）：311-314，315.

［2］徐峰.人血白蛋白275例臨床應用調查分析［J］.現代實用醫學，2013，25（3）：334-336.

［3］嚴汝慶.人血白蛋白臨床應用研究進展［J］.中國熱帶醫學，2013，13（7）：902-905.

［4］韓一波，宣澤勝.人血白蛋白使用的臨床藥學干預［J］.醫學信息，2013（29）：447.

［5］朱素燕，徐萍，劉瑤，等.人血白蛋白臨床應用1580例調查與分析［J］.中國藥物與臨床，2015（1）：22-25.

［6］王松.呼吸機膜材料的選擇及其生物相容性［J］.中國組織工程研究，2012，16（12）：2221-2224.

［7］李榮，王衡東，王文峰，等.聚丙烯無紡布親水性與血液相容性改性初步研究［J］.中國輸血雜志，2012，25（11）：1165-1169.

［8］石強，門小菲，趙杰，等.用于血液存儲與輸注的聚丙烯材料的制備［J］.中國輸血雜志，2011，24（11）：933-935.

［9］毛志剛，陳朝輝，韓宏光.人工血管材料生物相容性和血液相容性的研究與分析［J］.中國組織工程研究，2012，16 （16）：2981-2988.

［10］陳歐，邱雄，邵澤勇，等.血液透析膜生物相容性及在重癥胰腺炎中的應用［J］.中國組織工程研究，2016，20（8）：1177-1182.

Preparation and Properties of a Kind of Human Albumin and Polyethylene Glycol Derivatives

LI Dan，WANG Wei，ZHU Wei-bin，LIN Gao-pin
Hangzhou City，Zhejiang Province，Ya Hui biological Science and Technology Co.，Ltd，Hangzhou，Zhejiang Province，310052 China

R313

A

2096-1782（2016）08-0005-03

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.08.005

李丹（1982.11-），浙江杭州人，博士，中級工程師，研究方向：生物醫用材料。

2016-06-05）