乳腺癌患者新輔助化學治療后ERCC1基因表達情況研究

鄭銳年，林順歡，關 靈，林欽雄，劉 淳，盧志斌，吳少敏

（廣東省東莞市人民醫院，廣東 東莞 523000）

乳腺癌患者新輔助化學治療后ERCC1基因表達情況研究

鄭銳年，林順歡，關 靈，林欽雄，劉 淳，盧志斌，吳少敏

（廣東省東莞市人民醫院，廣東 東莞 523000）

目的研究乳腺癌新輔助化學治療（簡稱化療）對核苷酸切除修復基因ERCC1表達的影響及臨床意義。方法逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT－PCR)檢測正常健康志愿者活檢組織（18例），常規手術切除的乳腺癌標本（28例）和術前曾接受新輔助化療的乳腺癌標本（18例）中ERCC1基因的表達，分析其表達與乳腺癌臨床病理特征的相關性以及乳腺癌新輔助化療對其的影響。結果無化療組患者的ERCC1基因表達水平顯著低于正常組（P＜0．05）。無化療組乳腺癌中ERCC1基因表達水平與患者的年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、病理分型、組織學分級、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮因子受體－2(HER－2)均無明顯相關性(P＞0．05)。新輔助化療組ERCC1基因的表達水平明顯高于無化療組(P＜0．05)。結論與正常人相比，乳腺癌患者ERCC1基因表達水平顯著下降(P＜0．05)，而ERCC1基因的表達水平與乳腺癌的臨床病理特征無相關性，患者經過新輔助化療后ERCC1基因的表達水平可出現上調，對乳腺癌患者實施化療治療具有參考意義。

ERCC1基因；乳腺癌；新輔助化療

切除修復交叉互補基因 1(excision repair cross complementing gene 1，ERCC1）是人類細胞DNA損傷后核苷酸切除修復途徑基因家族中重要的成員之一。ERCC1基因位于染色體19q13．2，長度15 kb，編碼由297個氨基酸殘基組成的蛋白質。ERCC1基因的表達產物可特異性連結5′端的核酸內切酶，具有損傷識別和切除5′端的雙重作用。目前，大量研究證實ERCC1基因的低表達常伴隨癌癥發病率的增加。為了解ERCC1基因在健康人群、乳腺癌患者以及接受新輔助化學治療（簡稱化療）后的乳腺癌患者中的表達情況，筆者對新輔助化療或無新輔助化療的46例乳腺癌臨床標本以及18例健康志愿者采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT－PCR)法進行檢測，并對ERCC1基因的臨床意義進行初步探討。

1 資料與方法

1．1 一般資料

選取2012年8月至2015年8月我院收治的46例乳腺癌患者，均知情同意并接受手術治療。根據術前治療情況將患者分為化療組（n＝18）和無化療組（n＝28）。化療組患者中，年齡28～59歲，平均（40．5±10．2）歲；臨床分期為Ⅱ期14例，Ⅲ期4例；淋巴結轉移情況為伴有5例，不伴有13例；病理類型為非特殊型癌15例，特殊型癌3例；組織學分級為為Ⅰ級2例，Ⅱ級9例，Ⅲ級7例。無化療組患者中，年齡28～67歲，平均（43．2± 10．1）歲；臨床分期為Ⅰ期8例，Ⅱ期16例，Ⅲ期4例；淋巴結轉移情況為伴有5例，不伴有23例；病理類型為非特殊型癌24例，特殊型癌4例；組織學分級為Ⅰ級6例，Ⅱ級12例，Ⅲ級10例。另選取在我院行健康體檢的志愿者18例為正常組，年齡28～62歲，平均（41．5±11．5）歲。所有試驗均經醫院醫學倫理委員會批準，均簽署知情同意書。3組對象年齡、性別資料比較，差異均不顯著（P＞0．05），具有可比性。

1．2 方法

1．2．1 治療方法

化療組患者曾接受的新輔助化療方案包括：TE方案，多西他賽(TXT)75 mg／m2，第 1天，表阿霉素(EPI)75 mg／m2，第1天，21 d為1周期；TEC方案，TXT 75 mg／m2，第 1天，EPI 75 mg／m2，第 1天，環磷酰胺(CTX）500 mg／m2，第1天，21 d為1個周期；4EC－4T方案：EPI 75 mg／m2，第1天，CTX 500 mg／m2，第1天，TXT(多西他賽)75 mg／m2，第1天。任選一種上述方案，化療2～8個療程。

1．2．2 RT－PCR檢測

3組患者均進行RT－PCR檢測，采用總RNA提取試劑盒及RT－PCR試劑盒(深圳晶美生物公司)。

總RNA提取：取300 mg乳腺癌組織，在液氮預冷的研缽中放置研磨，用藥匙收集放入15 mL的EP管，加入Trizol液，組織和Trizol液的比例為100 mg∶1 mL，充分混勻后靜置5 min。運用氯仿－異丙醇法將總RNA提取出來，電泳可見3個條帶，即28S，18S，5S。用紫外分光光度計對 RNA的純度進行鑒定，對 A260nm／A280nm的比值進行測定，使其維持在1．8～2．0。

第一鏈cDNA合成：1 μg總RNA＋1 μL oligo(dT) 18引物，焦碳酸二乙酯(DEPC)水補到12 μL，70℃的溫度下孵育5 min，冰上驟冷;順序加入4 μL 5×buffer＋2 μL 10 mmol／L dNTP＋20 U Ribonuclease inhibitor，37℃放置，孵育 5 min，加 200 UM－MuLV，終體積為20 μL。42℃放置，孵育60 min，70℃放置，孵育10 min，冰上驟冷，cDNA保存在－20℃。

鏈擴增：PCR引物（上海生工公司合成，見表1），反應體系為50 μL去離子水＋5 μL 10×PCR緩沖液＋5 μL cDNA＋2 μL 25 mmol／L MgCl2＋1 μL 10 mmol／L dNTP＋2．5 U Taq酶＋25 pmol上游特異引物＋25 pmol下游特異引物，充分混勻，在較短的時間內離心，94℃預熱5 min，進行30個循環的擴增：94℃、55℃、72℃、94℃分別變性30 s、退火30 s、延伸40 s、延伸5 min。

表1 PCR引物

電泳檢測：用1．0%瓊脂糖凝膠對擴增產物進行電泳，將電泳電壓穩定在500 V／m 1．0 h左右，用5 g／L溴化乙錠(EB)染色20 min，然后在紫外燈、凝膠成像系統、LabWorkS4圖形分析處理系統分別觀察、拍照成像、分析。

ERCC1 mRNA的相對表達量＝ERCC1擴增帶灰度／內參β－actin擴增帶灰度。

1．3 統計學處理

2 結果

結果見表2和表3。

3 討論

20世紀70年代末以來，全球乳腺癌發病率一直呈上升趨勢[1]。近年，我國乳腺癌發病率的增長速度也已高出高發國家1%～2%。2012年國家癌癥中心、衛生部疾病預防控制局公布的2009年乳腺癌發病數據顯示，全國腫瘤登記地區乳腺癌發病率高居女性惡性腫瘤的首位，女性乳腺癌發病率（粗率）全國合計為42．55／10萬，城市為51．91／10萬，農村為23．12／10萬，乳腺癌已成為當前社會的重大公共衛生問題[2]。自 20世紀 90年代，全球乳腺癌死亡率呈下降趨勢；究其原因，一是乳腺癌篩查工作的開展，使早期病例的比例增加；二是乳腺癌綜合治療的開展，提高了療效，乳腺癌已成為療效最佳的實體腫瘤之一[3]。

表2 3組對象ERCC1基因表達水平比較（s）

表2 3組對象ERCC1基因表達水平比較（s）

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表3 無化療組患者ERCC1基因的表達水平與臨床病理特征的相關性（s）

表3 無化療組患者ERCC1基因的表達水平與臨床病理特征的相關性（s）

t／F值0．229 P值0．82腫塊大小（cm）0．5860．56病理類型例數13 15 13 12 3 240．4340．67組織學分級＞40＜2 2～5＞5非特殊型癌特殊型癌Ⅰ級Ⅱ級Ⅲ級46 0．8200．45腋淋巴結0．3650．72 PR 0．4160．68 ER＋－＋－＋－0．5230．60 HER－2＋＋／＋＋＋－／＋12 10 5 23 14 14 18 10 9 19 ERCC1 mRNA 0．961±0．047 0．973±0．033 0．958±0．021 1．003±0．048 1．010±0．026 0．974±0．041 1．002±0．040 1．041±0．041 0．965±0．048 0．946±0．041 1．003±0．035 0．962±0．036 0．982±0．059 0．962±0．023 0．965±0．042 0．991±0．020 1．003±0．023 0．957±0．0290．8470．40

DNA的合成和修復異常與腫瘤的發生、多藥耐藥均有密切聯系，其中核苷酸切除修復(nucleotide excision repair，NER)是導致鉑類藥物耐藥的重要機制。NER通路由多種DNA修復酶組成，ERCC1基因是NER通路中的限速基因，其編碼的ERCC1蛋白參與DNA損傷識別和DNA鏈的切割，在DNA修復過程中具有重要作用。目前，大量研究證實ERCC1基因的低表達常伴隨癌癥發病率的增加[4－6]。因此，ERCC1基因表達水平與腫瘤易感性、化療藥物療效預測、臨床預后等相關性的研究，是近期臨床研究的熱點。

目前，有關ERCC1基因在乳腺癌中表達的研究，大多關注蛋白質水平。一項國際研究[7]對504例早期乳腺癌患者標本行ERCC1免疫組化檢測并分析，結果表明，ERCC1蛋白表達并不能反映乳腺癌手術的預后，但ERCC1過表達與ER陽性、較低T分期、淋巴結陰性和年齡超過50歲有關，與遠處轉移、生存率無關。

本研究結果表明，無化療組患者與正常健康患者相比，ERCC1基因的表達水平顯著降低，與之前相關研究結果一致[8]；28例無化療組患者的ERCC1 mRNA相對表達水平與不同年齡、腫塊大小、病理類型、組織學分級、腋淋巴結轉移情況、ER表達、PR表達、HER－2表達等臨床病理特征無相關，說明ERCC1蛋白或mRNA表達水平或許不是一個預后不良因素。但本研究樣本量較少，其結論有待大數據的臨床研究進一步證實。

此外，本研究結果還顯示，18例接受新輔助化療患者組織的ERCC1 mRNA相對表達水平顯著高于無化療組（P＜0．05），說明ERCC1基因的表達水平在乳腺癌新輔助化療后可上調，有利于乳腺癌的治療。

[1]唐金海，姚宇鋒．早期乳腺癌的診斷和外科治療進展[J]．中國普外基礎與臨床雜志，2011，18(9)：913－916．

[2]方瓊英，吳 瓊，張秀玲，等．乳腺癌的流行現狀分析[J]．中國社會醫學雜志，2012，29(5)：333－335．

[3]莫 淼，柳光宇，呂力瑯，等．乳腺癌篩查研究進展[J]．腫瘤，2012，32(9)：748－754．

[4]Rosell R，Felip E，Paz Ares L，et al．How could pharmacogenomics help improve patient survival[J]．Lung Cancer，2007，57(S2): S35－S41．

[5]Peters GJ，Van Moorsel CJ，Lakerveld B，et al．Effects of gemcitabine on cis－platinum－DNA adduct formation and repair in a panel of gemcitabine and cisplatin－sensitive or resistant human ovarian cancer cell lines[J]．Int J Oncol，2006，28(1):237－244．

[6]Rosell R，Danenberg KD，Alberola V，et al．Ribonucleotide reductase messenger RNA expression and survival in gemcitabine／cisplatin－treated advanced non－small cell lung cancer patients[J]．Clin Cancer Res，2004，10(4):1 318－1 325．

[7]Goyal S，Parikh RR，Green C，et al．Clinicopathologic significance of excision repaircross－complementation 1 expression in pa－tients treated with breast－conserving surgery and radiation therapy[J]．Int J Radiat Oncol Biol Phys，2010，76(3):679－684．

[8]Adam Vilmar，Jens Benn S?rensen．Excision repair cross－complementation group 1(ERCC1)in platinum－based treatment of non－small cell lung cancer with special emphasis on carboplatin: A review of current literature[J]．Lung Cancer，2009，64(2): 131－139．

Expression of ERCC1 Gene in Breast Cancer after Neoadjuvant Chemotherapy

Zheng Ruinian，Lin Shunhuan，Guan Ling，Lin Qinxiong，Liu Chun，Lu Zhibin,Wu Shaomin
（Dongguan People′s Hospital，Dongguan，Guangdong，China 523000）

Objective To study the expression of ERCC1 gene in breast cancer after neoadjuvant chemotherapy．Methods The expression of ERCC1 gene was detected by RT－PCR in 28 breast cancer patients without neoadjuvant chemotherapy and in 18 breast cancer patients treated with neoadjuvant chemotherapy．The expression and clinicopathological features of breast cancer as well as the relevance of the impact of neoadjuvant chemotherapy on it were analyzed．Results No chemotherapy patients ERCC1 expression level was significantly lower than the normal group,the difference was statistically significant(P＜0．05)．The differences of ERCC1 gene expression levels of the non chemotherapy group between different ages,tumor sizes,histological types,histological grades,axillary lymph nodes,PR, ER,HER－2 were not significant(P＞0．05)．Neoadjuvant chemotherapy group ERCC1 gene expression levels were significantly higher than those without chemotherapy group,the difference was statistically significant(P＜0．05)．Conclusion Compared with the normal, ERCC1 gene expression levels were significantly decreased in patients with breast cancer(P＜0．05)and ERCC1 gene expression and Clinical pathological characteristics of breast cancer not associated,after neo－adjuvant chemotherapy in patients with raised the ERCC1 gene expression can occur,chemotherapy in the treatment of breast cancer patients have some reference value．

ERCC1 gene；breast neoplasms；neoadjuvant chemotherapy

R969．4；R979．1

A

1006－4931(2016)05－0024－03

鄭銳年（1983－），男，在職博士研究生，主治醫師，研究方向為肺癌靶向治療、肝癌靶向治療，（電子信箱）aweifrom＠163．com，2857311978＠qq．com。

2015－09－10)

廣東省東莞市科技計劃項目，項目編號：2015105101180。