復合纖維素分解菌的探討

文│王琳 王新梅 王蓓蓓（安徽省鳳陽縣畜牧獸醫局）

復合纖維素分解菌的探討

文│王琳 王新梅 王蓓蓓（安徽省鳳陽縣畜牧獸醫局）

近年來，農作物秸稈和畜禽糞肥的不合理利用，既造成了生物資源的浪費，又污染了環境。如何將這些生物資源“變廢為寶”是目前亟待解決的問題。大量試驗研究表明，這些廢棄物的主要有機成分是纖維素，由于秸稈中木質纖維素占干重的40%～60%，且自然狀態下極難分解。因此，纖維素的生物降解已成為生物技術處理有機固體廢物的關鍵，也是生物學領域的熱點問題。

本文從土壤和不同材料的堆肥中分離篩選高效纖維素分解菌，并研究其對溫度、pH的適應性，以便對纖維素分解菌進行優化來加快堆肥的腐熟進度。

一、材料與方法

1.試驗材料。

（1）樣本。從鳳陽縣府城鎮及周邊地區采集雞糞、農作物秸稈及一些腐殖質等。從采集的樣本中篩選得到相關菌種。

（2）培養基。初篩培養基：NaNO32.5克，KH2PO41克，CaCl2·6H2O 0.1克，MgSO40.3克，NaCl 0.1克，FeCl30.01克，濾紙條10克，蒸餾水1000毫升，溫度121℃，滅菌20分鐘。

復篩培養基：羧甲基纖維素鈉培養基（CMC培養基）。NaCl6克，MgSO4·7H2O 0.1克，KH2PO40.5克，CaCl20.1克，K2HPO42.0克，CMCNa 15克，（NH4）2SO42.0克，pH7.0～7.4，蒸餾水1000毫升，固體培養基加2%瓊脂。

優化培養液：Mandels培養基。KH2PO43.0克，CaCl20.5克，MgSO4·7H2O0.5克，NaCl0.1克，FeCl30.01克，NaNO33.0克，FeSO4·7H2O 7.5毫克，MnSO4·7H2O 2.5毫克，ZnSO4·7H2O 2.0毫克，CoCl23.0毫克，H2O 1000毫升，121℃滅菌20分鐘，pH7.2～7.3。

（3）無淀粉濾紙。濾紙用1%醋酸浸泡24小時，用碘液檢查確定無淀粉后再用2%蘇打水沖洗至中性，晾干，將處理后的濾紙剪成小條待用。

2.試驗方法。

（1）初選。初選是將原始菌種接種在初篩液體培養基中增殖培養。樣品用生理鹽水浸泡30分鐘，充分震蕩，吸取上清液1毫升接種到20毫升的三角燒瓶初篩培養基中，30℃恒溫震蕩搖床60轉/分鐘的條件下培養3～7天后，觀察濾紙的崩解程度，選擇濾紙條崩解程度較高、速度最快和效果穩定的培養液進行固體分離純化培養。

（2）復選。復選是將初選菌種接種在固體培養基上進一步純化分離。用接種環從有濾紙水解的三角燒瓶中蘸取分解菌，在貼有濾紙的復選平板上畫線，32℃下培養7天。對濾紙的分解效果測定是將各菌株接種到以濾紙為惟一碳源的CMC培養基中，觀察濾紙的崩解效果，以“+”的多少來表示濾紙崩解程度，“+”越多說明該菌株的降解效果越強，并計算CMC酶相對活性H=T/t（厘米/天），式中：H為相對活性；T為透明圈直徑；t為培養時間。重復此操作選擇分解纖維素能力強的菌落，將其放入4℃的冰箱保存，以備優化分析用。

（3）菌種的條件優化。將復選的菌種在28℃、32℃、35℃、38℃、40℃條件下分別接種在pH為6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0的Mandels培養基中，觀察并記錄濾紙條的崩解速度。

將每組篩選的最優pH條件下的菌種再次接種，放在28℃、32℃、35℃、38℃、40℃條件下培養，選出溫度和pH間最優的關系。

二、結果與分析

1.菌種的篩選。采用以濾紙為惟一碳源的培養基，從土壤和不同材料的堆肥中篩選纖維素分解菌，經多次富集增殖培養后，獲得10組具有纖維素降解功能的微生物，其中混合菌株H4具有穩定的分解纖維素效果，在以濾紙為碳源的液體培養基中發酵7天，濾紙全部崩解，并沒有絮狀沉淀，形成完全溶解的黃色稍黏稠發酵液。

將H4混合菌株用CMC平板進行分離純化得到單個菌株D1（放線菌）、D2（細菌）、D3（真菌），比較單個菌株以及相互混合對濾紙分解的效果（表1），結果表明各菌株單獨培養對濾紙均有一定的分解效果，但遠不如混合的效果好，由此說明3株菌株之間有很好的協同效應，故選擇混合菌H4作為優化菌種。

2.菌種不同溫度下最適pH變化。

（1）分別在28℃、32℃、35℃、38℃、40℃條件下優化。將H4分別接種在裝有濾紙條、pH為6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0的Mandels培養基中，分別在28℃、32℃、35℃、38℃、40℃恒溫振蕩搖床上培養7天觀察結果（表2）。

試驗結果表明，溫度在28℃時，偏酸性的環境更有利于濾紙的分解，pH過高反而抑制濾紙的分解；在32℃時纖維素分解菌最適分解的pH為中性；在35℃時纖維素分解菌最適分解的pH為7.2，偏堿性，溫度較高時，酸性條件下不適宜H4混合菌對濾紙的分解，分解速度明顯變慢。由此可得出，H4混合菌在pH分別為6.8、7.0、7.2時分解濾紙能力最強。

3.最適溫度的條件優化。將H4混合菌接種在pH分別為6.8、7.0、7.2帶有濾紙的Mandels培養基中，溫度分別為28℃、32℃、35℃、38℃、40℃的振蕩搖床60轉/分鐘的條件下培養，直至濾紙完全崩解時所用的天數，并記錄（表3）。

本試驗通過多次分離篩選得到纖維素分解菌，秸稈的分解是由各種微生物參與的生物氧化降解過程。微生物分解會產熱，致使秸稈堆內溫度升高，達到一定溫度時會導致微生物出現死亡或休眠，從而引起堆體溫度下降，下降到最適溫度時，休眠狀態的微生物開始繼續活動，如此反復。正是由于秸稈堆在發酵過程中溫度的變化，因而測定不同溫度對纖維素分解菌纖維素酶活性的影響，對于篩選高效的纖維素分解菌具有重要的實踐意義。

同時提取出來的H4混合纖維素分解菌包括細菌、真菌、放線菌，即細菌的最適溫度在35～37℃，pH在7.2～7.6；真菌的最適溫度在28～30℃，pH在6.5～6.8；放線菌的最適溫度在23～37℃，pH在7.5～8.0，因而測定不同溫度和pH對H4混合菌酶活性的影響，對于篩選高效的纖維素分解菌具有重要的實踐意義。

表1 不同菌株對濾紙的分解效果

表2 不同溫度下纖維素分解菌分解濾紙能力由強到弱順序

表3 濾紙完全崩解時所用的天數

三、結論

纖維素分解菌的分離還存在一些爭議，但通過與單一菌株的混合發酵相比，H4混合菌可使纖維分解能力明顯提高，這是由于不同菌株產生不同類型的纖維素酶，混合后相互作用的結果。試驗表明：纖維素分解受pH和溫度影響較大，發酵過程中需調節發酵液的pH，保持中性或偏堿性可達到很好的分解效果；溫度在35℃時纖維素分解酶活性最強，分解速度最快。H4混合菌的最適溫度是35℃，最優pH為7.2，可以看出H4混合菌中含有大量的細菌和放線菌，而真菌受到抑制。因此選擇濾紙作為碳源是較好的纖維素分解菌初選和增殖的培養基，為降解秸稈和有機廢棄物對環境的污染有重要意義，同時也可以利用纖維素分解菌分解秸稈生產酵母蛋白飼料提供有效參考。

試驗結果顯示，經過篩選的混合菌株具有較強的協同作用，對纖維素有很好的降解能力，對其進一步優化降解能力明顯增強。這對我國農村秸稈和城市有機廢棄物的處理將有非常廣闊的應用前景。