玻璃化冷凍人卵母細胞體外受精-胚胎移植9例臨床分析▲

黃 華 伍玲園 唐秀法 陳自洪 孫燕萍 牛向麗

(廣西壯族自治區(qū)人口和計劃生育研究中心生殖醫(yī)學科，南寧市 530021，E-mail：86168263@qq.com)

論著·臨床研究

玻璃化冷凍人卵母細胞體外受精-胚胎移植9例臨床分析▲

黃 華 伍玲園 唐秀法 陳自洪 孫燕萍 牛向麗

(廣西壯族自治區(qū)人口和計劃生育研究中心生殖醫(yī)學科，南寧市 530021，E-mail：86168263@qq.com)

目的 探討人卵母細胞玻璃化冷凍在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)中的應用效果。方法 行IVF-ET治療、因取卵日男方因素無法進行受精的患者9例，對其成熟卵子進行玻璃化冷凍保存，解凍后進行卵胞漿內(nèi)顯微授精(ICSI)，記錄卵子復蘇、受精、卵裂及移植后妊娠情況。結(jié)果 9例患者共解凍復蘇58枚卵子，復蘇率68.2%(58/85)；復蘇后進行ICSI的成熟卵子中，受精40枚，形成胚胎34枚，受精率69.0%，卵裂率85.0%。7個移植周期共移植胚胎15枚，臨床妊娠3例，臨床妊娠率42.9%。結(jié)論 人卵母細胞玻璃化冷凍可以獲得一定的臨床妊娠率，在IVF-ET中可作為臨床治療的選擇之一。

體外受精；胚胎移植；玻璃化冷凍；卵胞漿內(nèi)精子顯微注射；卵母細胞

卵母細胞冷凍保存是一種發(fā)展迅速的技術(shù)，具有重要的現(xiàn)實意義和社會價值，該技術(shù)的應用逐漸增多。我國實施“二孩”政策以后，卵母細胞冷凍應用前景更加廣闊。細胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶是冷凍過程中造成卵子功能受損的主要原因之一。與胚胎、精子相比，卵子的表面積與體積比值小，這導致了卵子在慢凍過程中更加不易脫水，進而在細胞內(nèi)更容易形成冰晶，損傷細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)，這可對卵子的發(fā)育潛能產(chǎn)生不利影響，甚至導致卵子凋亡。玻璃化冷凍卵子技術(shù)是近年來輔助生殖領(lǐng)域的一項熱門新技術(shù)，能有效地解決冷凍過程中產(chǎn)生冰晶的問題。該技術(shù)不需要程序冷凍儀，操作簡單、迅捷、效率高，而且費用相對較低。其原理是在高濃度冷凍保護劑作用下將卵母細胞快速降溫，使胞漿由液態(tài)變?yōu)闃O其黏稠的非結(jié)構(gòu)的玻璃態(tài)而無任何形式的冰晶形成。在卵子解凍過程中也同樣能完全不形成冰晶，從而減少低溫凍融對細胞產(chǎn)生的損傷[1]。該技術(shù)將卵子保存在-196℃液氮中，最長可保存30年，且保持排卵時的正常狀態(tài)[2]。玻璃化冷凍技術(shù)從1995年開始用于人卵子的冷凍保存，因其能更好地保持卵子的生理功能，并獲得更好的妊娠結(jié)局，逐漸被廣泛認可，近年來被越來越多生殖中心應用于臨床[3]。2013年美國生育年會頒布的指導原則也表明，成熟卵子的冷凍已經(jīng)不再局限于實驗研究[4]。但是，目前國內(nèi)外不同生殖中心采用的載體、保護劑及冷凍程序等不盡相同，世界范圍內(nèi)還沒有統(tǒng)一標準的玻璃化冷凍方案，對保護劑和載體的選擇及冷凍程序等仍未達成共識[5]。許多研究致力于改進卵子玻璃化冷凍條件，探討在體外受精中最佳的玻璃化冷凍方法。隨著臨床中玻璃化冷凍技術(shù)的不斷推廣和逐步完善，卵母細胞玻璃化冷凍技術(shù)也發(fā)展迅速，與新鮮卵母細胞相比，玻璃化冷凍卵子的受精率、卵裂率和臨床妊娠率無統(tǒng)計學差異[6]。在臨床上，有小部分患者在體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo tranfer，IVF-ET)采卵日因男方因素無法獲得精子，通過行卵子玻璃化冷凍有效地解決了這一問題，避免了卵子的浪費，給廣大不孕不育患者帶來了福音。近年來本生殖中心根據(jù)單位現(xiàn)有條件，借鑒國內(nèi)外先進生殖中心的經(jīng)驗，應用人類成熟卵母細胞玻璃化冷凍這一技術(shù)，取得了較好的臨床結(jié)局。本文分析9例在取卵當日因為男方取精失敗而行卵子玻璃化冷凍的患者的臨床結(jié)局，探討卵子玻璃化冷凍技術(shù)在IVF-ET應用的可行性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2011年3月至2015年6月在我中心行IVF-ET助孕治療的患者9例，均在取卵當日無法獲得男方精子，年齡23～36歲，平均31.8歲。在簽署知情同意書后行成熟卵子玻璃化冷凍。

1.2 卵子凍融方法

1.2.1 卵子冷凍方法：采用日本加藤公司的玻璃化冷凍冷卻盒和瑞典Vitrolife公司的卵子處理液G-mops-plus。其中，玻璃化冷凍冷卻盒包括平衡液(equilibration solution，ES)和玻璃化溶液(vitrification solution，VS)。配備凍卵所用冷凍液滴前，以上液體需要提前30 min于25℃室溫進行平衡。將G-mops-plus 2 ml加入3001培養(yǎng)皿中，用剝卵器將已脫顆粒的成熟卵子移入，漂洗去油。在3003培養(yǎng)皿的皿蓋配置G-mops-plus及ES微滴待用，其中G-mops-plus微滴1個，ES液滴3個(ES1、ES2、ES3)，各約20 μl，G-mops-plus液滴與ES1、ES2盡量等大且成等邊三角形排列。漂洗去油后的卵子首先移至3003皿蓋的G-mops-plus液滴。1 min后將G-mops-plus與ES1連線，計時2 min，由于滲透壓的不同，過程中可見卵子飄向G-mops-plus液滴頂端；在G-mops-plus與ES1連線的中點與ES2再次連線，計時2 min；最后將卵子移至ES3液滴放置5 min。卵子置于ES3液滴期間，在3003皿蓋繼續(xù)配置VS液滴3個，每個約10 μl，反復用VS液清洗剝蝕的吸管。5 min后將卵子從ES3中移至VS液滴，依次漂洗數(shù)次，至最后一個VS液滴停留，準備裝載，在VS液中的總時間需大于90 s但小于120 s。裝載體積小于2 μl。裝載后將載體投入盛有液氮的容器，再次核對標識后移入液氮罐。

1.2.2 解凍卵子：采用日本KITAZATO公司的玻璃化冷凍解凍試劑盒，解凍液由解凍液(thawing solution，TS)、稀釋液(dilute solution，DS)和洗液-1(washing solution-1，WS-1)及WS-2 4部分組成。在使用前，也需要提前30 min將TS于37℃進行平衡，DS、WS-1和WS-2于25℃室溫平衡。首先，從液氮中取出Cryotop載桿，將裝有卵子的載桿前端快速浸入TS中，把卵子從 Cryotop 載桿上洗脫，此過程不超過1 min。然后，將卵子迅速移至DS中，讓卵子自然下沉。3 min后再將卵子置于WS-1中，5 min后將卵子移至WS-2中。再過5 min后，將形態(tài)完全恢復的卵子轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中。對復蘇的成熟卵子全部進行卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)。

2 結(jié) 果

解凍了9例患者共85枚玻璃化冷凍成熟卵子，復蘇了58枚，復蘇率68.2%；對復蘇的58枚MⅡ期卵子全部進行ICSI，共受精40枚，受精率69.0%(40/58)，形成了胚胎34枚，卵裂率85.0%(34/40)，優(yōu)胚率32.3%(11/34)。7個移植周期移植胚胎15枚。移植后2周，抽血驗β-HCG，2周后對陽性者行B超檢測，有孕囊和出現(xiàn)胎心搏動者可判斷為臨床妊娠，臨床妊娠共3例(42.9%)，其中1例為宮外孕，1例單胎足月分娩一健康男嬰，另1例單胎仍在妊娠中，已有38周，發(fā)育正常。剩余3枚冷凍胚胎。9例患者的凍融結(jié)果及妊娠情況見表1。

表1 9例患者的凍融結(jié)果及妊娠情況

3 討 論

玻璃化冷凍法利用高濃度保護劑溶液，使胚胎受凍時胞漿能從液態(tài)變?yōu)闊o結(jié)構(gòu)的玻璃狀態(tài)，這種玻璃狀態(tài)能使處于溶液狀態(tài)的分子和離子得以保持很好的分布，不產(chǎn)生細胞內(nèi)結(jié)晶，不需充分脫水，滲透壓與跨膜物質(zhì)濃度相差不大，不易產(chǎn)生不可逆的細胞膜理化損傷而引起細胞死亡[7]，冷凍過程中細胞內(nèi)容易形成冰晶，從而使細胞膜及細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)受損，導致染色體異常，對細胞造成致命傷害，而玻璃化冷凍法很好地解決了這一問題[8]。玻璃化冷凍技術(shù)是體外受精實驗室一個很好的工具，使輔助生殖有了更多的選擇并增加了靈活性。玻璃化冷凍的出現(xiàn)推動了常規(guī)臨床實踐的期望結(jié)局的發(fā)展，無論是在提高解凍后的存活率、臨床妊娠率，還是加強對植入前遺傳學診斷的臨床效果，此技術(shù)都有不俗的表現(xiàn)[9]。

人類卵母細胞體外保存已經(jīng)成為輔助生殖技術(shù)進步的客觀要求。作為一種發(fā)展迅速的冷凍技術(shù)，玻璃化冷凍技術(shù)的優(yōu)點正逐漸被認識[5]。雖然，玻璃化冷凍卵母細胞解凍后的復蘇率、受精率及移植妊娠率等都較前有所提高，但是，目前的卵子玻璃化冷凍技術(shù)還不夠成熟，人們對冷凍卵子的成熟階段、冷凍程序、冷凍劑等方面仍未全面了解[1]。雖然經(jīng)過冷凍和解凍程序之后卵母細胞存活率似乎有所改善，但一個重要問題是體外成熟(in vitro maturation，IVM)與受精率低及未成熟的卵母細胞冷凍緊密相關(guān)[10]。然而，也有研究表明在未成熟GV期和在成熟MⅡ期玻璃化冷凍卵母細胞的存活率沒有顯著差異[11]。李娜等[12]選取未成熟卵子進行研究，將GV期卵子(220枚)直接行玻璃化冷凍，同時將GV期卵子(155枚)直接行IVM，待培養(yǎng)至MⅡ期，再行玻璃化冷凍，兩組間存活率、成熟率、受精率、卵裂率和囊胚形成率無差異，說明GV期卵子直接冷凍或體外培養(yǎng)至 MⅡ期冷凍效果相當。

本實驗室采用的是美國玻璃化冷凍方法，冷凍試劑是日本KITAZATO公司的玻璃化冷凍解凍試劑盒和瑞典Vitrolife公司的G-mops-plus，9例患者共解凍復蘇了85枚卵子，復蘇率68.2%，高于秦文松等[13]報告的59.62%，與耿潔等[14]報告的68.57%相似，但低于滕曉明等[8]報告的83.02%；復蘇后的成熟卵子進行ICSI，受精率69.0%，與秦文松等[13]報告的67.74%、滕曉明等[8]報告的72.73%相似，低于耿潔等[14]的91.67%； 卵裂率85.0%，與耿潔等[14]報告的86.36%相似，但低于秦文松等[13]報告的95.24%、滕曉明等[8]報告的93.75%； 7個移植周期共移植胚胎15枚，臨床妊娠3例，獲得了42.9%的移植妊娠率，與秦文松等[13]、耿潔等[14]報告的40%相似，高于滕曉明等[8]報告的22.22%。雖然ICSI 輔助受精能夠大大提高凍融卵子的受精率，但是并不能提高卵裂率及優(yōu)質(zhì)胚胎率，后兩者決定于精子與卵子的質(zhì)量[15]。我們只獲得了68.2%的復蘇率，可能與經(jīng)驗不足有關(guān)，因此，在卵子復蘇率上還有待進一步提高，凍融后卵子的受精及其胚胎發(fā)育需進一步深入研究，提高卵裂率。

穩(wěn)定成熟的卵子冷凍技術(shù)是臨床應用的前提，國內(nèi)外有關(guān)卵子的玻璃化冷凍在睪丸取精失敗周期中的臨床應用僅有有限的文獻報告，臨床可行性尚需大樣本證實[16]。經(jīng)過冷凍和解凍程序之后GV期卵母細胞IVM困難依然存在[17]。本中心初步應用該技術(shù)，還存在卵子復蘇率(68.2%)、優(yōu)胚率(32.3%)偏低的問題，說明在卵子的玻璃化冷凍及解凍過程中，超低溫可能給細胞透明帶、超微結(jié)構(gòu)(如膜結(jié)構(gòu)、細胞骨架等)、紡錘體等帶來了損傷，使冷凍卵子復蘇后不能完全自我修復，從而不能發(fā)育成優(yōu)質(zhì)胚胎，甚至囊胚[18]。從妊娠結(jié)局來看，3例臨床妊娠所移植的胚胎均有優(yōu)質(zhì)胚胎，說明卵子在冷凍、解凍、ICSI后若能形成優(yōu)質(zhì)胚胎，則該胚胎具備良好的發(fā)育潛能，移植后更有可能獲得理想的結(jié)局，也說明我生殖中心采用的卵子玻璃化冷凍體系是可行的。隨著實踐經(jīng)驗的積累，該體系可不斷完善成為成熟的卵子玻璃化凍融方案。

凍存卵母細胞活產(chǎn)嬰兒的數(shù)量在過去十年迅速增加，玻璃化冷凍技術(shù)的發(fā)展必然伴隨著產(chǎn)科和圍產(chǎn)期結(jié)局，以及嬰兒的長期發(fā)展評估[17]。尤其是標本直接與液氮接觸帶來的污染問題以及高濃度冷凍保護劑的毒性影響，還有冷凍技術(shù)本身帶來的一定遺傳風險都決定今后研究方向應為冷凍方法的優(yōu)化與安全性[8]。由于缺乏高育齡婦女的數(shù)據(jù)和用于長期儲存的卵母細胞凍存數(shù)據(jù)，迄今文獻可靠性也存在局限性[17]。因此，這些信息還不能涵蓋整個生殖醫(yī)學領(lǐng)域。一項研究初步分析了玻璃化冷凍卵母細胞后的165例妊娠者和200名嬰兒的產(chǎn)科和圍產(chǎn)期結(jié)局[18]，其平均出生體重和先天畸形的發(fā)生率與不孕婦女接受體外受精治療或自然懷孕育齡婦女相當，這提示通過使用卵子玻璃化冷凍治療出現(xiàn)的低懷孕率和低出生體重嬰兒率與產(chǎn)科和圍產(chǎn)期結(jié)局風險的增加不相關(guān)。僅意大利就有約2 000名為卵母細胞凍存出生的嬰兒，至今沒有異常嬰兒數(shù)量增加的報告[11]。目前有限的資料提示此項技術(shù)是安全的，但還需要進一步的研究。

隨著進一步的深入研究，卵母細胞玻璃化冷凍的標準程序?qū)惶岢觯删C合女性的年齡和冷凍保存的原因，為其提供合理的信息以幫助做出明智的選擇，以解決女性生育力保存的問題。未來對于卵母細胞凍存的研究成果，將為輔助生殖治療提供更深入的見解。

[1] 盧興宏,黃艷儀,龍曉林,等.不同成熟階段、不同來源的人類卵子冷凍后發(fā)育潛能的比較[J].實用醫(yī)學雜志,2006,22(12):1 378-1 379.

[2] 佚名.什么叫“玻璃化冷凍卵子技術(shù)”?[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2005,13(7):124.

[3] Nagy ZP,Chang CC,Shapiro DB,et al.Clinical evaluation of the efficiency of an oocyte donation program using egg cryo-banking[J].Fertil Steril,2009,92(2):520-526.

[4] Cil AP,Seli E.Current trends and progress in clinical applications of oocyte cryopreservation[J].Curr Opin Obstet Gynecol,2013,25(3):247-254.

[5] 唐志霞,曹云霞.卵子玻璃化冷凍保存生育力的研究進展[J].中國婦幼健康研究,2008,19(4):368-370.

[6] Cobo A,Diaz C.Clinical application of oocyte vitrification:a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J].Fertil Steril,2011,96(2):277-285.

[7] 孫燕萍,牛向麗,陳自洪,等.玻璃化與程序化兩種不同胚胎凍融方法的臨床應用效果比較[J].中國計劃生育和婦產(chǎn)科,2011,3(1):22-25.

[8] 滕曉明,李昆明,王 羽,等.卵子玻璃化冷凍在體外受精-胚胎移植中的初步應用[J].中華男科學雜志,2012,18(6):531-533.

[9] Simopoulou M,Asimakopoulos B,Bakas P,et al.Oocyte and embryo vitrification in the IVF laboratory:a comprehensive review[J].Folia Med(Plovdiv),2014,56(3):161-169.

[10]Mandelbaum J,Bela?sch-Allart J,Junca AM,et al.Cryopreservation in human assisted reproduction is now routine for embryos but remains a research procedure for oocytes[J].Hum Reprod,1998,13(Suppl 3):161-174.

[11]Cao Y,Xing Q,Zhang ZG,et al.Cryopreservation of immature and in-vitro matured human oocytes by vitrification[J].Reprod Biomed Online,2009,19(3):369-373.

[12]李 娜,苗聰秀,關(guān)素萍,等.玻璃化冷凍法在未成熟卵子冷凍技術(shù)中的應用[J].中國計劃生育學雜志,2012,20(10):690-692.

[13]秦文松,劉 英,秦輝靈,等.人卵母細胞玻璃化冷凍技術(shù)在輔助生殖中的應用[J].中國性科學,2015,24(2):93-95.

[14]耿 潔,胡玉琴,劉蘭蘭.卵子玻璃化冷凍在體外受精-胚胎移植取精失敗周期中的應用[J].實用醫(yī)院臨床雜志,2014,11(1):156-157.

[15]徐千花,曹云霞.卵子冷凍在女性生育力保存中的作用研究進展[J].國際生殖健康/計劃生育雜志,2008,27(5):276-279.

[16]宋文妍,孫瑩璞,金海霞,等.卵子玻璃化冷凍在睪丸取精失敗周期中的臨床應用(附8例報告)[J].中華男科學雜志,2010,16(4):305-309.

[17]Chian RC,Wang Y,Li YR.Oocyte vitrification:advances,progress and future goals[J].J Assist Reprod Genet,2014,31(4):411-420.

[18]Chian RC,Huang JY,Tan SL,et al.Obstetric and perinatal outcome in 200 infants conceived from vitrified oocytes[J].Reprod Biomed Online,2008,16(5):608-610.

In vitro fertilization and embryo transfer using human oocytes with vitrified cryopreservation:a report of 9 cases

HUANGHua,WULing-yuan,TANGXiu-fa,CHENZi-hong,SUNYan-ping,NIUXiang-li

(ResearchCenterforPopulationandFamilyPlanningofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530021,China)

Objective To explore the effect of vitrification of human oocytes applied to in vitro fertilization and embryo transfer(IVF-ET).Methods Nine patients who could not be fertilized due to male factors underwent IVF-ET.The mature ova of these patients were treated with vitrified cryopreservation.Intracytoplasmic sperm injection(ICSI) was conducted after the ova were thawed.The recovery,fertilization,segmentation and pregnancy after transplantation were recorded.Results A Total of 58 ova were thawed in the 9 patients,and the recovery rate was 68.2%(58/85) .Of the mature ova received ICSI after recovery,40 ova were fertilized and 34 developed into embryos.The fertilization rate and segmentation rate were 69.0% and 85.0% respectively.In 7 transplantation cycles,15 embryos were transplanted and clinical pregnancy was completed in 3 cases,and the clinical pregnancy rate was 42.9%.Conclusion Vitrified cryopreservation of human oocytes can achieve satisfactory clinical pregnancy rate.IVF-ET can be one of the choices for clinical therapy. 【Key words】 In vitro fertilization,Embryo transfer,Vitrified cryopreservation,Intracytoplasmic sperm injection,Oocyte

廣西壯族自治區(qū)計劃生育委員會科研項目(桂人口計生研1109，桂人口計生研1102)

黃華(1983～)，男，碩士，助理研究員，研究方向：胚胎實驗。

牛向麗(1978～)，女，碩士，助理研究員，研究方向：胚胎實驗，E-mail：59075287@qq.com。

R 169

A

0253-4304(2016)07-0941-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.07.14

2016-02-04

2016-05-04)