輔助T細胞17及其相關調控因子在特應性皮炎患者中的表達情況及其臨床意義▲

王魯梅 曾碧冰 李俊杰 盧婉嬌 張 斌

(廣東省東莞市人民醫院皮膚科，東莞市 523000，E-mail：wangluomei952@163.com)

論著·臨床研究

輔助T細胞17及其相關調控因子在特應性皮炎患者中的表達情況及其臨床意義▲

王魯梅 曾碧冰 李俊杰 盧婉嬌 張 斌

(廣東省東莞市人民醫院皮膚科，東莞市 523000，E-mail：wangluomei952@163.com)

目的 探討輔助T細胞17(Th17)及其相關調控因子白細胞介素-23(IL-23)和微小RNA155(miR-155)在特應性皮炎(AD)患者外周血中的表達情況及其臨床意義。方法 選擇54例AD患者和30例健康對照者，檢測受試者外周血白細胞中Th17比例、IL-23、miR-155的表達水平，分析3者診斷AD的敏感性和特異性以及3者與AD嚴重程度特應性皮炎評分(SCORAD)的相關性。結果 AD患者Th17比例、IL-23和miR-155表達水平均顯著高于健康對照者(P<0.05)；Th17比例、IL-23和miR-155診斷AD的敏感性分別77.64%、65.30%和82.19%，特異性分別為62.81%、74.28%和77.06%；Th17比例、IL-23和miR-155表達水平均與SCORAD評分呈正相關(P<0.05)。結論 IL-23和miR-155可能參與了AD中Th17細胞的表達調控，Th17細胞及其相關因子尚不能作為AD的診斷指標，但可以輔助判斷其疾病嚴重程度。

特應性皮炎；輔助T細胞17細胞；白細胞介素-23；微小RNA-155

特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種具有遺傳傾向的慢性、復發性瘙癢性皮膚病，以皮膚干燥、瘙癢和炎癥為特點，同時伴有血清中IgE水平增高和嗜酸粒細胞增多，其發病機制極其復雜且至今未明[1]。輔助T細胞(T helper cell，Th)17作為近年來發現的一種重要免疫細胞，在多學科多種疾病的發病機制中受到廣泛關注[2]。白細胞介素(interleukin，IL)-23和微小RNA(microRNA，miR)-155分別是Th17細胞的2個重要調控因素，其中IL-23作為調控細胞因子，通過促進Th17的生物活性，誘導其表達特異性效應因子IL-17而發揮病理作用，其在紅斑狼瘡、天皰瘡和銀屑病等多種皮膚病發病機制中的作用研究中均得到證實[3]。而miR-155作為調控Th17的微小蛋白質，目前已被證實是Th17分化所必需的miR之一[4]，目前有關在AD患者中是否也存在miR-155高表達并對Th17細胞進行調控鮮有文獻報道。因此，本研究通過檢測AD患者外周血中Th17及其2個重要調控因素IL-23和miR-155的表達情況，并分析其與疾病嚴重程度的相關性，以探討3者在AD診斷和病情評估中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年6月至2015年5月在我院門診就診的AD患者54例，納入標準：AD的診斷符合文獻[5]中的診斷標準；患者檢測前1周停止系統和外用糖皮質激素以及免疫抑制劑治療，停用抗組胺藥1周以上，無光療1個月以上。排除標準：存在其他皮膚病或內臟疾病史者。其中男28例、女26例，年齡10～42(25.68±9.78)歲，病程9～32(17.68±6.54)年。選擇健康志愿者30例作為健康對照組，其中男14例、女16例，年齡12～38(22.68±9.78)歲，均無家族和個人過敏史，無皮膚病或內臟病史。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究取得醫院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2 標本采集 采集各組受試對象晨起空腹時的外周靜脈血5 ml，440×g離心10 min，分離血漿，采用Ficoll密度梯度離心法分離、獲取外周血漿和外周血單一核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，標本于-70℃保存待檢。

1.3 Th17細胞檢測 采用流式細胞儀檢測外周血Th17比例(IL17+CD4+T細胞/CD4+T細胞%)：將PBMC放入含10%胎牛血清的RPMI 160培養液(美國Gibco公司，批號：GNM 31800)中并調整濃度至2×106細胞/ml，先后加人50 μg/L佛波酯、1 mg/L鈣離子載體和10 mg/L布雷菲德菌素A(均購自美國Sigma公司，批號：FK-LM125)，37℃、5% CO2條件下共刺激培養5 h。首先細胞膜用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)-CD4單克隆抗體標記，透膜、固定后PE-L17單克隆抗體細胞染色，染色步驟參考說明書進行(均購自美國eBioscience公司)。用FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)檢測標本，應用WinMDI2.9軟件分析數據。

1.4 IL-23表達水平檢測 采用酶聯免疫吸附實驗檢測外周血IL-23的表達水平，酶聯免疫吸附實驗試劑盒購自美國eBioscience公司(批號：17992406)，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.5 miR-155表達水平檢測 采用實時定量RT-PCR法檢測外周血PBMC中miR-155的表達水平：用Trizol RNA提取試劑(美國Invitrogen公司，批號：RP2401)按說明書提取PBMC中的總RNA，紫外分光光度儀測定其純度，吸光度值(A260/A280)在1.8～2.0之間為合格樣本。利用miR-155莖環引物5′-GTCGTATC CAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCTAT-3′、內參U6反轉錄引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′及oligo(dT)，按M-MLV反轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司，批號：20D09H)說明書合成對應的cDNA。使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒(日本Toyobo公司，QPK-212)，并分別以U6和β肌動蛋白為內參照，引物序列為：(1)目的基因miR-155上游引物5′-TGCCTCCAACTGACTCCTAC-3′，下游引物 5′-GCGAGCACAGAATAATACGAC-3′。(2)內參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCACACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT -3′。β肌動蛋白上游引物5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTC-3′，下游引物5′-TCACCTTC ACCGTTCCAGTTT-3′。在Rotor-Gene 3000實時PCR儀(澳大利亞Corbett Research公司)進行miR-155的定量檢測。數據應用分析軟件(Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0)和雙標準曲線法進行分析。

1.6 病情程度的評價 采用歐洲AD研究組提出的特應性皮炎評分[6](scoring atopic dermatitis index，SCORAD)進行評估，包括客觀體征皮膚病變范圍(A)和皮損嚴重程度(B)，主觀癥狀瘙癢和影響睡眠程度(C)，計分值計算公式為A/5+7B/2+C。

1.7 統計學分析 應用SPSS 18.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以(x±s)表示，比較采用獨立樣本t檢驗，不符合正態分布的計量資料采用秩和檢驗；正態分布的資料采用Pearson相關性分析，非正態分布的資料采用Spearman相關性分析。3個指標的診斷效能分析采用受試者工作曲線進行。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組PBMC中Th17比例比較 AD患者PBMC中Th17細胞比例為(1.78±0.20)%，高于對照組的(0.47±0.20)%(t=12.145，P<0.001)。

2.2 兩組IL-23和miR-155的表達水平比較 AD患者的IL-23及miR-155的表達水平均高于健康對照者(P<0.05)，見表1。

表1 AD患者和健康對照者IL-23和miR-155的表達水平(x±s)

2.3 相關性分析 AD患者中，Th17比例(r=0.415，P=0.034)、IL-23表達水平(r=0.577，P=0.036)、miR-155表達水平(r=0.426，P=0.011)均與SCORAD評分正相關；IL-23表達水平、miR-155表達水平均與Th17細胞比例呈正相關(r=3.577，P=0.036；r=6.426，P=0.049)。

12.4 Th17細胞比例、IL-23和miR-155的表達水平診斷AD的敏感性和特異性 Th17比例診斷AD的截斷值為2.01%，曲線下面積為0.677，敏感性為77.64%，特異性為62.81%。IL-23水平診斷AD的截斷值為374.55 pg/ml，曲線下面積為0.704，敏感性為65.30%，特異性為74.28%。PBMC中miR-155水平診斷AD的截斷值為3.63，曲線下面積為0.813，敏感性為82.19%，特異性為77.06%。

3 討 論

IL-23作為調控Th17的細胞因子，可誘導Th17細胞增殖、活化及終末分化，增加已分化細胞的數量，并在維持其生存及產生Thl7記憶形成中起關鍵作用，同時促進Thl7產生一定水平的IL-17[7-8]；IL-17可作為前炎性介質募集中性粒細胞等炎性細胞，誘發多種炎癥損傷[7]。目前有研究已證實，AD患者外周血中Th17細胞、IL-17蛋白表達水平明顯上調，且與病情嚴重程度呈正相關[9-10]。另有學者發現，在卵白蛋白誘導的小鼠AD模型中，皮膚樹突細胞是表達IL-23的主要來源細胞[11]，IL-23是誘導皮膚初始T細胞分化為Th17細胞的關鍵因子[11]。這提示在AD患者中可能也存在IL-23的高表達并對Th17細胞存在正調控。

本研究結果顯示，AD患者外周血中IL-23蛋白表達水平和Th17比例高于健康對照組(P<0.05)，且與病情的嚴重程度(SCORAD評分)呈正相關(P<0.05)，這一結果與國內文獻報道相一致[9-10]；同時IL-23與Th17比例呈正相關(P<0.05)。這些結果表明，在AD患者高表達IL-23，高表達的IL-23對Th17存在正性調控，使Th17比例也相應上調，而Th17產生的IL-17可能也相應升高，IL-17作為前炎性介質可促進AD炎癥反應發生，因此，隨著病情的嚴重程度增加，兩組的表達水平也隨著升高。而高表達的IL-23病理機制形成可能是AD中因多種因素所致瘙癢、搔抓引起的皮膚機械損傷，誘發皮膚樹突狀細胞攜帶抗原從皮膚游走至淋巴結產生較多的IL-23[12]。

miR-155是一種多功能的miR分子，已被證實能夠明顯影響先天性免疫和適應性免疫過程，如炎癥介導、抗原提呈、T細胞分化、細胞因子產生等[13]。miR-155為Th17分化所必需的因素，缺失miR-155的T細胞不能正常分化為Th17細胞[14]。本研究結果顯示，AD患者外周血miR-155表達水平明顯增高(P<0.05)，且表達水平與疾病嚴重程度評分呈正相關(P<0.05)；同時AD患者miR-155的高表達與Th17細胞比例呈正相關(P<0.05)。這些結果表明，在AD中高表達的miR-155也對Th17正性調控，使Th17比例相應上調，其表達水平隨病情的加重而升高，提示miR-155參與AD的疾病發生過程。IL-23、miR-155雖均為Th17的調控因素，但二者在促進Th17分化和功能的調控機制上卻存在著不同，且各為獨立。IL-23作為細胞因子作用于Th17的受體發揮調控作用[8]。而細胞因子信號抑制物1是miR-155的直接靶基因，miR-155通過JAK/STAT信號途徑抑制細胞因子信號抑制物1的表達，進而促進CD4+T細胞中Th17的分化與功能[15]。

本研究進一步分析了Th17比例、IL-23和miR-155作為診斷AD的可行性，但結果表明3者診斷AD的特異性和敏感性并不高，因此Th17細胞及其相關因子是否可以作為AD的診斷指標尚需進一步研究。但Th17比例、IL-23和miR-155與AD的SCORAD評分顯著相關，因此臨床可考慮將其作為判斷疾病嚴重程度的客觀指標之一。

綜上所述，IL-23和miR-155可能參與了AD中Th17的表達調控，但Th17細胞及其相關因子尚不能作為AD的診斷指標，但可以輔助判斷其疾病嚴重程度，因此在臨床的應用中仍具有較好的前景。

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Expression and clinical significance of T helper cell 17 and its related regulatory control factors in patients with atopic dermatitis

WANGLu-mei,ZENGBi-bing,LIJun-jie,LUWan-jiao,ZHANGBing

(DepartmentofDermatology,DongguanPeople′sHospital,Dongguan523000,China)

Objective To explore the expression and clinical significance of T helper cell 17(Th17) and its related regulatory control factors including interleukin-23(IL-23) and microRNA-155(miR-155) in peripheral blood of the patients with atopic dermatitis(AD).Methods A total of 54 patients with AD and 30 healthy individuals were enrolled.Then the proportion of Th17 in peripheral leukocytes,and the expression levels of IL-23 and miR-155 in peripheral blood were detected in all participants.The sensitivity and specificity of the three factors for the diagnosis of AD were analyzed.And the correlation of the three factors with AD severity[scoring atopic dermatitis index(SCORAD)] was assessed.Results The proportion of Th17,and the expression levels of IL-23 and miR-155 of AD patients were significantly higher than those of healthy individuals(P<0.05).The sensitivities of proportion of Th17,IL-23 and miR-155 for the diagnosis of AD were 77.64%,65.30% and 82.19%,respectively,while the specificities were 62.81%,74.28% and 77.06%,respectively.The proportion of Th17,IL-23 and miR-155 expression levels positively correlated with SCORAD score (P<0.05).Conclusion IL-23 and miR-155 may be involved in regulating the expression of Th17 cell in AD.Th17 cell and its related regulatory factors still can not act as the diagnostic indicator for AD,but they are helpful for evaluating the severity of disease.

Atopic dermatitis,T helper cell 17,Interleukin-23,microRNA-155

廣東省東莞市科技計劃醫療衛生類科研項目(201410515000050)

王魯梅(1972～)，女，碩士，副主任醫師，研究方向：白癜風，特應性皮炎。

李俊杰(1964～)，男，碩士，主任醫師，研究方向：皮膚美容，E-mail：RDPbird4451@163.com。

R 593.2

A

0253-4304(2016)03-0342-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.03.13

2015-12-19

2016-02-15)