冬凌草甲素對膽管癌QBC939細胞增殖、凋亡及端粒酶活性的影響

丁明勇 王衛星

(武漢大學人民醫院肝膽腹腔鏡外科，武漢市 430060，E-mail：dingmingyongwk@sina.com)

論著·基礎研究

冬凌草甲素對膽管癌QBC939細胞增殖、凋亡及端粒酶活性的影響

丁明勇 王衛星

(武漢大學人民醫院肝膽腹腔鏡外科，武漢市 430060，E-mail：dingmingyongwk@sina.com)

目的 探討冬凌草甲素對膽管癌細胞系QBC939細胞增殖、凋亡及端粒酶活性的影響。方法 采用不同濃度冬凌草甲素(0、10、20、40、80、100 μmol/L)處理QBC939細胞24、48、72 h，MTT法測定QBC939細胞活力并計算增殖抑制率；不同濃度冬凌草甲素(0、20、40、80 μmol/L)處理QBC939細胞48 h后，分別采用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率，Western Blot法檢測QBC939細胞B淋巴細胞瘤-2蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)的表達，端粒酶重復序列擴增法檢測QBC939細胞的端粒酶活性。結果 QBC939細胞增殖抑制率隨冬凌草甲素的藥物濃度升高、作用時間延長而升高；與0 μmol/L冬凌草甲素組相比，其他濃度冬凌草甲素組的S期細胞比例降低；0、20、40、80 μmol/L冬凌草甲素組QBC939細胞的凋亡率分別為0.5%、14.8%、25.8%及37.7%；Western Blot結果顯示隨著藥物濃度的升高，QBC939細胞的Bax表達量逐漸升高，Bcl-2表達量逐漸降低；其他濃度冬凌草甲素組QBC939的端粒酶活性均低于0 μmol/L冬凌草甲素組，且QBC939細胞的端粒酶活性隨冬凌草甲素濃度的升高而降低(P<0.05)。結論 冬凌草甲素可抑制QBC939細胞增殖并誘導其凋亡，其作用機制可能與抑制Bcl-2表達以降低端粒酶活性有關。

膽管癌；冬凌草甲素；QBC939細胞；增殖；凋亡；端粒酶活性；B淋巴細胞瘤-2蛋白

冬凌草甲素又稱為延命草寧、冬凌草素，其為從冬凌草中提取出來的有效活性成分，是一種以貝殼杉烯為骨架的四環二萜類化合物。藥理學實驗發現其具有抗炎、降血壓、抗菌等多種藥理活性[1]。近年來，大量研究證實冬凌草甲素對食管癌、肝癌、膀胱癌及肺癌等多種腫瘤細胞均具有明顯的抑制作用[2-5]。而目前有關冬凌草甲素對膽管癌細胞作用的文獻資料相對較少。本研究以膽管癌QBC939細胞為研究對象，觀察冬凌草甲素對QBC939細胞增殖、凋亡及端粒酶活性的影響，并分析其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 細胞株：膽管癌QBC939細胞購自中國科學院上海細胞庫，由武漢大學中心實驗室凍存。主要試劑：冬凌草甲素購自上海詩丹德生物技術有限公司(純度>98%，批號20131201)，用二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO) 配制成10 mmol/L(DMSO的終濃度小于0.1%)的母液，-20℃保存；胎牛血清購自杭州四季青公司(批號140412)，DMEM培養液購于碧云天生物技術研究所(批號20131123)；AnnexinV/PI凋亡檢測試劑盒購于Bender公司；端粒酶檢測試劑盒(Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA)購自德國Roche公司(批號20140314)；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒(批號20140311)、辣根酶標記山羊抗兔或山羊抗鼠IgG購自武漢博士德生物科技有限公司(批號2014401)；B淋巴細胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X，Bax)及β-肌動蛋白(β-actin)抗體購自Cell Signaling Technology公司(批號分別為20131221、20140212、20140128)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：細胞接種到培養瓶中，置于37℃含5% CO2的細胞培養箱中培養，2～3 d后觀察培養基顏色及培養瓶內細胞生長情況，若培養基顏色變淡而細胞未長滿則將培養瓶從培養箱中取出，在無菌操作臺上操作，棄去培養基，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)清洗2～3遍，加入適量新培養基，繼續放入培養箱中培養。

1.2.2 MTT法檢測細胞活力：取3塊96孔板，每塊板上劃分為6個區域用于接種6組細胞，每組細胞含3個復孔，同時準備好細胞計數板；將處于對數生長期的細胞用胰酶消化后，用完全培養基重懸成細胞懸液；各組細胞按2 000/孔接種于96孔板上，每孔加培養基100 μl，鋪板過程中確保每個孔接種的細胞數目一致，鋪板完成后將96孔板放入37℃、5% CO2的培養箱中；細胞貼壁后各組分別加入冬凌草甲素終濃度為0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L的培養液，其中0 μmol/L濃度組設為對照組。3塊培養板分別培養24 h、48 h、72 h，在培養終止前4 h，每孔內加入10 μl 5 mg/ml的MTT，4 h后棄去培養液，每孔加入100 μl的DMSO終止反應。用振蕩器振蕩10 min后，在酶標儀上檢測490 nm的吸光度，即A值。根據公式計算細胞增殖抑制率：細胞抑制率(%)=[1-(實驗組平均A值-調零孔A值)/(對照組平均A值-調零孔A值)]×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期：將對數生長期的細胞接種于6孔板中，貼壁后棄上清。將細胞分為5組，實驗組分別加入含冬凌草甲素(終濃度為0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L)的培養液，對照組加入等量培養液，放置培養箱中繼續孵育48 h后收集細胞，加入70%乙醇，4℃固定，放置過夜，次日放入37℃水中放置30 min，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)，避光4℃孵育15 min。篩網過濾后流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡：細胞接種及分組方法同“1.2.3”，收集細胞，收集培養上清于5 ml離心管中，用D-Hanks液洗滌細胞1次后用胰酶消化細胞，消化完全后收集細胞于同一5 ml離心管中，以1 500 r/min離心5 min，棄去上清。PBS洗滌細胞沉淀1次，同樣以1 500 r/min離心5 min，收集細胞。再用結合緩沖液(1×)洗滌細胞沉淀1次，以1 500 r/min離心5 min后收集細胞，加入染色緩沖液(1×)重懸細胞，調整細胞密度為5×106個/ml左右。取5 μl Annexin V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)加入100 μl細胞懸液進行染色，室溫下避光放置10 min，將染色后的細胞懸液置于流式上機管中，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.5 Western Blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達變化：細胞接種及分組方法同“1.2.3”，收集細胞，用冷的PBS洗滌3遍，棄去PBS，加入三去污蛋白裂解液，置于冰上裂解30 min，用雙蒸水泡過的細胞刮收集瓶中液體于離心管中，4℃，12 000 r/min離心10 min，吸取上清，置于-80℃冰箱儲存。氰基丙烯酸正丁酯(butylcyanoacrylate，BCA)法測定蛋白質濃度，加入5×上樣緩沖液至提取的細胞蛋白樣品中，沸水煮沸5 min使蛋白質變性。將膠板固定在電泳架上，加入電泳緩沖液，每孔加入40 μg蛋白樣品，同時在兩側的上樣孔中加入5 μl蛋白標記作為分子量參照。電泳結束后轉膜至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，根據條帶蛋白分布不同加入1 ∶1 000稀釋的兔抗人Bax及Bcl-2蛋白，放入4℃冰箱內搖床上孵育過夜，其中β-actin為內參。次日采用洗膜洗滌緩沖液洗膜后，根據一抗來源不同分別加入1 ∶1 000稀釋的辣根酶標記的山羊抗兔二抗，室溫放置2 h，再次洗膜洗滌緩沖液洗膜，使用電化學發光試劑，在室溫下孵育聚偏二氟乙烯膜后放入暗盒中，暗室紅燈下曝光1 min，然后顯影，定影，對膠片進行拍照分析，觀察膠帶上條帶蛋白的顯影。

1.2.6 端粒酶重復序列擴增法檢測端粒酶活性：根據端粒酶檢測試劑盒說明書進行操作，即細胞接種及分組方法同“1.2.3”，收集細胞，用冷的PBS洗滌3遍，棄去PBS，加入裂解液，置于冰上裂解30 min，4℃下1 600 r/min 離心20 min，小心取上清液，-80℃保存；取待測樣品50 μg，靶位區域擴增多態性(target region amplification polymorphism，TRAP)-聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增，取5 μl擴增產物行產物雜交和ELISA檢測。酶標儀上檢測加入終止液30 min內450 nm的吸光值，根據試劑盒內標的A值和控制模板的A值，得到所測樣本的相對定量數值。

1.3 統計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料以(x±s)表示，多組均數的比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度冬凌草甲素對QBC939細胞增殖的影響 在各個時間點，A490值隨冬凌草甲素的濃度升高而降低(P<0.05)；QBC939細胞的增殖抑制率隨冬凌草甲素的藥物濃度升高、作用時間延長而升高。見表1。

表1 不同濃度冬凌草甲素組QBC939細胞的增殖抑制率(x±s)

注：各時間點，組間兩兩比較，P均<0.05。

2.2 冬凌草甲素對QBC939細胞周期的影響 0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的冬凌草甲素處理QBC939細胞48 h后，流式細胞儀檢測細胞周期分布結果顯示，與0 μmol/L冬凌草甲素組相比，其他濃度冬凌草甲素組的S期細胞比例降低，見圖1。

圖1 不同濃度冬凌草甲素組QBC939細胞周期

A：0 μmol/L冬凌草甲素組；B：20 μmol/L冬凌草甲素組；C：40 μmol/L冬凌草甲素組；D：80 μmol/L冬凌草甲素組。

2.3 冬凌草甲素對QBC939細胞凋亡的影響 0 μmol/L冬凌草甲素組凋亡率僅為0.5%，20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L冬凌草甲素處理QBC939細胞48 h后，細胞凋亡率上升，分別為14.8%、25.8%及37.7%，提示冬凌草甲素能誘導QBC939細胞凋亡。見圖2。

圖2 不同濃度冬凌草甲素組QBC939細胞凋亡率A：0 μmol/L冬凌草甲素組；B：20 μmol/L冬凌草甲素組；C：40 μmol/L冬凌草甲素組；D：80 μmol/L冬凌草甲素組。左下象限(D3/E3)為正常細胞；左上象限(D1/E1)為壞死細胞，右上象限(D2/E2)為早期凋亡細胞，右下象限(D4/E4)為晚期凋亡細胞。

2.4 冬凌草甲素對QBC939細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax表達的影響 Western Blot結果顯示隨著藥物濃度的升高，促凋亡蛋白Bax表達量逐漸升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達量逐漸降低，見圖3。

圖3 不同濃度冬凌草甲素組QBC939細胞的Bax、Bcl-2表達

2.5 冬凌草甲素對QBC939細胞端粒酶相對活性的影響 各濃度冬凌草甲素組QBC939的端粒酶相對活性比較，差異有統計學意義(P<0.05)，其他濃度冬凌草甲素組QBC939的端粒酶相對活性均低于0 μmol/L冬凌草甲素組，且QBC939的端粒酶相對活性隨冬凌草甲素濃度的升高而降低(P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度冬凌草甲素作用后QBC939細胞的端粒酶相對活性(x±s)

注：組間兩兩比較，P均<0.05。

3 討 論

近年來流行病學研究發現，膽管癌的發病率呈上升趨勢[6]。手術切除仍是目前最有效的治療方法。但膽管癌惡性程度高，起病隱匿，臨床上早期診斷困難，多數患者就診時就已經處于晚期；且由于肝門部膽管癌所在解剖部位復雜，手術難度較大，臨床上根治性手術率較低，僅30%左右，同時，根治性手術后患者5年生存率僅13.4%～25.75%。因此需要進一步探討新的治療方法。許多天然化合物不斷地被發現并應用于人類疾病治療的研究。冬凌草甲素是從冬凌草中提取出來的有效活性成分，本研究發現，冬凌草甲素在10～100 μmol/L濃度范圍，對膽管癌QBC939細胞的增殖抑制作用呈時間和濃度依賴性，即藥物濃度越高、作用時間越長，其發揮增殖抑制效果亦越好。細胞增殖是通過細胞周期的運轉來實現的，本研究中流式細胞儀檢測細胞周期分布的結果顯示，與0 μmol/L冬凌草甲素組相比，其他濃度冬凌草甲素組的S期細胞比例降低，表明冬凌草甲素可阻滯QBC939細胞G1期行進和G1/S轉換，提示冬凌草甲素可能通過阻滯細胞周期抑制細胞增殖；此外，本研究結果顯示，冬凌草甲素處理后QBC939細胞的凋亡率升高，凋亡率隨洋務濃度升高而升高，提示冬凌草甲素可促進QBC939細胞凋亡，且呈劑量依賴性。這些結果表明冬凌草甲素可能通過阻滯細胞周期、抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡發揮抗腫瘤作用。

本研究進一步探討了冬凌草甲素誘導細胞凋亡的機制。Bcl-2是重要的凋亡調節蛋白，主要存在于線粒體、內質網和核膜上，Bcl-2的過表達可導致細胞持續增殖，進而引起腫瘤的發生。研究發現在多種腫瘤細胞中Bcl-2均成過表達狀態[7]。Bcl-2可通過增強線粒體膜電位，保持線粒體內外膜的完整性，并抑制鈣離子釋放，阻止核酸內切酶活化等多種機制抑制細胞凋亡，在腫瘤發生及發展中扮演著重要角色[8-9]。此外，Bcl-2還可通過與細胞外調節蛋白激酶通路相互作用，調節細胞凋亡[10]。研究證實，抑制或阻斷Bcl-2表達可促進細胞凋亡，患者生存期亦可明顯延長[11]；Bax屬于是Bcl-2家族，但其作用與Bcl-2相反，Bax即可與自身形成同源二聚體，又可與Bcl-2相互結合形成異源二聚體，研究發現，抗凋亡蛋白Bcl-2表達上調時可促進自身與Bax結合形成異源二聚體，發揮抗凋亡作用，Bcl-2表達下調時，則出現相反的效應；即細胞Bcl-2/Bax比例改變可調節細胞凋亡[12]，此外，Bax還可通過直接激活死亡效應因子半胱氨酸蛋白酶，改變細胞膜通透性促進細胞凋亡。本研究結果顯示，冬凌草甲素處理QBC939細胞48 h后，可引起細胞促凋亡蛋白Bax表達量逐漸升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達量則逐漸降低，且呈劑量依賴性。

端粒酶是由RNA和蛋白組成的特殊的反轉錄酶，可以端粒DNA的3c末端為引物，以自身RNA為模板，在S期的線粒體末端添加端粒DNA中TTAGGG重復序列，彌補細胞分裂DNA復制過程中端粒的縮短，維持端粒長度和DNA穩定。正常細胞中，端粒的結合蛋白和相關蛋白可負性調節端粒長度，抑制端粒酶活性[13]。變異細胞激活端粒酶后，可借其穩定染色體末端結構的功能，幫助細胞跳過凋亡臨界狀態，成為不死細胞。因此，端粒酶激活可引起細胞無限增殖、細胞永生化，導致腫瘤的發生[14]。本實驗結果顯示，冬凌草甲素處理QBC939細胞48 h后，端粒酶活性隨著藥物濃度的升高而逐漸降低。有研究表明在凋亡過程中，細胞的完整性受到破壞可影響到端粒酶的表達及活性，或端粒酶活性受凋亡相關基因的調控[15]。凋亡抑制基因Bcl-2可調控端粒酶活性，當Bcl-2表達上調時，端粒酶活性增強，反之減弱[16]。提示冬凌草甲素可能通過下調Bcl-2減弱端粒酶活性，進而抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡。

綜述所述，冬凌草甲素在體外能抑制膽管癌QBC939細胞增殖并促進其凋亡，其作用機制可能與下調Bcl-2、減弱端粒酶活性有關。但是，本研究未探討冬凌草甲素對正常膽管上皮細胞是否存在毒性，以及體內毒性實驗及體內抗腫瘤實驗。在下一步的實驗中我們將進一步探討冬凌草甲素對體內外毒性試驗及體內抗腫瘤作用，為臨床應用于膽管癌的治療提供理論依據。

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Effects of oridonin on cell proliferation,apoptosis and telomerase activity of cholangiocarcinoma cell line QBC939

DINGMing-yong,WANGWei-xing

(DepartmentofHepatobiliaryandLaparoscopicSurgery,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

Objective To explore the effect of oridonin on the proliferation,apoptosis and telomerase activity of cholangiocarcinoma cell line QBC939.Methods QBC939 cells were treated by oridonin with different concentrations(0,10,20,40,80 and 100 μmol/L) for 24,48 and 72 hours.The viability of QBC939 cells was determined by MTT assay,and then the inhibitory rate for cell proliferation was calculated.After QBC939 cells treated by oridonin with different concentrations(0,20,40 and 80 μmol/L) for 48 hours,the cell cycle and apoptosis rate were analyzed by flow cytometry,and the expression levels of B-cell lymphoma-2(Bcl-2) and Bcl-2 assaciated X(Bax) protein in QBC939 cells were detected by Western Blot,and telomerase activity of QBC939 cells was measured by telomerase repeat amplification protocol.Results The inhibitory rate for QBC939 cell proliferation increased with the increase of concentration and acting time of oridonin.Compared to 0 μmol/L oridonin group,the other oridonin groups obtained lower percentages of S-phase cells.The apoptosis rates of QBC939 cells in 0 μmol/L,20 μmol/L,40 μmol/L and 80 μmol/L oridonin group were 0.5%,14.8%,25.8% and 37.7% respectively.The results of Western Blot showed that Bax expression increased gradually and Bcl-2 decreased gradually in QBC939 cells with the increase of drug concentration.The telomerase activity of QBC939 cells in the other oridonin groups was lower than that in 0 μmol/L oridonin group,and the telomerase activity of QBC939 cells reduced with the increase of origin in concentration(P<0.05).Conclusion Oridonin can inhibit the cell proliferation and induce the cell apoptosis in QBC939 cells,and the mechanism may be associated with the reduction of telomerase activity by inhibiting Bcl-2 expression. 【Key words】 Cholangiocarcinoma,Oridonin,QBC939 cell,Proliferation,Apoptosis,Telomerase activity,B-cell lymphoma-2 protein

丁明勇(1980～)，男，在讀碩士研究生，研究方向：肝膽胰疾病診療。

王衛星(1960～)，男，博士，主任醫師，教授，研究方向：肝膽胰疾病的診療，E-mail：wangweixinggd@sina.com。

R 735.8

A

0253-4304(2016)03-0308-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.03.04

2015-10-18

2016-01-07)