巴馬小型豬冠狀動(dòng)脈微栓塞后白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6及AU堿基富集區(qū)RNA結(jié)合因子1 mRNA的表達(dá)及意義▲

林士云 曾志羽 馬國(guó)添 吳 海 夏炳輝 阮 翔

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心內(nèi)科，南寧市 530021，E-mail：447922897@qq.com)

論著·基礎(chǔ)研究

巴馬小型豬冠狀動(dòng)脈微栓塞后白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6及AU堿基富集區(qū)RNA結(jié)合因子1 mRNA的表達(dá)及意義▲

林士云 曾志羽 馬國(guó)添 吳 海 夏炳輝 阮 翔

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心內(nèi)科，南寧市 530021，E-mail：447922897@qq.com)

目的 探討巴馬小型豬冠狀動(dòng)脈微栓塞(CME)后心肌組織白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)及AU堿基富集區(qū)RNA結(jié)合因子1(AUF1)的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況及其意義。方法 將30只巴馬小型豬分為假手術(shù)組(n=5)和CME組(n=25)。CME組經(jīng)微導(dǎo)管于左前降支中遠(yuǎn)端注入微栓塞球混懸液；假手術(shù)組注射等量生理鹽水。將CME組均分為5組于建模后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h進(jìn)行觀察；假手術(shù)組小型豬于6 h后進(jìn)行觀察。光鏡下觀察各組心肌組織改變，并檢測(cè)心肌組織IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA表達(dá)。結(jié)果 建模后6 h，CME組血管內(nèi)均可見微栓塞球，周圍出現(xiàn)微梗死灶。建模后6 h，與假手術(shù)組比較，CME組心肌組織IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA的表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)。CME組心肌組織IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA的表達(dá)水平都在建模后3 h和6 h升高，9 h達(dá)高峰，12 h和24 h下降；與3 h和24 h比較，CME組9 h心肌組織IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA的表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)。結(jié)論 IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA高表達(dá)于CME后心肌組織，并呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間變化規(guī)律。

冠狀動(dòng)脈微栓塞；白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1；腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6；AU堿基富集區(qū)RNA結(jié)合因子1；巴馬小型豬

在急性冠狀動(dòng)脈綜合征和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療過程中，粥樣硬化斑塊破裂產(chǎn)生的微小栓子可導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈微栓塞(coronary microembolization，CME)。CME可引起心肌微循環(huán)障礙，導(dǎo)致“慢復(fù)流”或“無復(fù)流”現(xiàn)象發(fā)生，嚴(yán)重影響患者的心功能及遠(yuǎn)期預(yù)后；研究表明CME致心功能損傷主要與心肌炎癥有關(guān)[1-2]。白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK1)及腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)是炎癥信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)調(diào)節(jié)分子，廣泛參與炎癥和免疫應(yīng)答[3-4]。AU堿基富集區(qū)RNA結(jié)合因子1(AU-rich element RNA-binding factor 1，AUF1)通過與mRNA 3′端未翻譯區(qū)上AU堿基富集區(qū)結(jié)合，調(diào)節(jié)mRNA降解，參與炎癥調(diào)控，并在心血管疾病中發(fā)揮重要作用[5]。因此，我們推測(cè)IRAK1、TRAF6及AUF1可能參與了CME后心肌炎癥，但有關(guān)其在CME后心肌組織中的表達(dá)情況和作用的研究甚少。為此，本研究通過探討CME后心肌組織IRAK1、TRAF6及AUF1表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，旨在為CME的臨床防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 微栓塞球(美國(guó)Biosphere Medical公司，規(guī)格40～120 μm)；TriPure Isolation Reagent試劑盒(美國(guó)Roche公司，批號(hào)11667165001)；All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)GeneCopoeia公司，批號(hào)AORT-0050)、All-in-OneTMqPCR Mix檢測(cè)試劑盒(美國(guó)GeneCopoeia公司，批號(hào)AOPR-0200)、All-in-OneTMqPCR Primer(美國(guó)GeneCopoeia公司)；iQ5TMReal-Time PCR Detection System(美國(guó)Bio-Rad公司)；NanoDrop?8000分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)；其他均為常規(guī)儀器和試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及模型建立 健康廣西巴馬小型豬30只，雌雄不拘，體重25～30 kg，45～55周齡，由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供(許可證號(hào)：SCXK桂2007-0003)。小型豬飼養(yǎng)于通風(fēng)清潔環(huán)境，規(guī)律照明，實(shí)驗(yàn)過程遵守《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則》及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。利用隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)分為CME組25只和假手術(shù)組5只。豬CME模型的建立參考馬國(guó)添等[6]報(bào)告的造模方法，具體步驟如下：小型豬經(jīng)氯胺酮和阿托品肌注誘導(dǎo)麻醉后，穿刺耳大靜脈給予戊巴比妥鈉靜脈滴注維持麻醉，如有躁動(dòng)不安則靜脈注射地西泮。分離暴露一側(cè)股動(dòng)脈，用21號(hào)Cordis橈動(dòng)脈穿刺針進(jìn)行穿刺，成功后置入6F橈動(dòng)脈鞘。經(jīng)鞘注入肝素200 U/kg達(dá)肝素化，此后以100 U/(kg·h)維持。行冠狀動(dòng)脈造影，隨之經(jīng)指引導(dǎo)管送入微導(dǎo)管至左前降支分出第一對(duì)角支后的遠(yuǎn)端，將10萬計(jì)數(shù)微栓塞球(微栓塞球混懸于20 ml生理鹽水中)經(jīng)微導(dǎo)管注入左前降支，20 min注射完畢。同樣操作過程，假手術(shù)組給予注射等量生理鹽水。將CME組小型豬隨機(jī)分為5組，每組5只，分別于建模后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h進(jìn)行觀察；假手術(shù)組在6 h進(jìn)行觀察。

1.3 組織取材及樣品處理 經(jīng)耳緣靜脈注射10 ml 10%氯化鉀注射液處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，開胸取出心臟，迅速取心尖處部分心肌放入焦碳酸二乙酯處理過的凍存管，投入液氮罐中，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，檢測(cè)IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA表達(dá)。另取心尖處部分心肌，4%多聚甲醛固定24 h后，蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，光鏡下觀察心肌組織改變。

1.4 IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 取約100 mg樣品至冷凍研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，按照Trizol 操作說明提取心尖心肌組織的總RNA，并用分光光度計(jì)測(cè)量其濃度和純度，采用cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄。采用SYBRGreenⅠ熒光標(biāo)記法檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，IRAK1 引物：上游：5′-TGATGCCCAAACTGGGAGAC-3′，下游：5′-GTCTTGACGTAGTCCTCGGG-3′；TRAF6 引物：上游：5′- CCAGAGACCCACAATCCCAC-3′，下游：5′-TGGAGACCTCACAGCGTACT-3′；AUF1 引物：上游：5′-GCCCAGGTTACGGTGGTTAT-3′，下游：5′-CCTCGCCTGGATACTTTCCC-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物：上游：5′-GCTACACTGAGGACCAGGTTG-3′，下游：5′-TACCAGGAAATGAGCTTGACG-3′。按試劑盒說明設(shè)置反應(yīng)體系及參數(shù)，每個(gè)樣本均進(jìn)行復(fù)孔檢測(cè)，同時(shí)每次反應(yīng)均設(shè)置陰性孔，PCR產(chǎn)物均經(jīng)過測(cè)序檢測(cè)。結(jié)果采用2-ΔΔCt法比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CME心肌組織病理學(xué)觀察 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組6 h未見明顯心肌微梗死灶；于建模后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h CME組血管內(nèi)均可見微栓塞球，周圍出現(xiàn)微梗死灶，周邊心肌水腫、變性，并有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和紅細(xì)胞滲出。見圖1、圖2。

圖1 微栓塞6 h 假手術(shù)組心肌組織病理改變(HE染色，×100)

圖2 微栓塞6 h CME組心肌組織病理改變(HE染色，×100)

注：箭頭示微栓塞球

2.2 CME建模后6 h IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA表達(dá)水平的變化 建模后6 h，與假手術(shù)組比較，CME組心肌組織IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA的表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 CME建模后6 h IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA表達(dá)水平的變化(x±s)

2.3 CME組建模后不同時(shí)點(diǎn)心肌組織IRAK1、TRAF6及AUF1表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化 CME組心肌組織IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA的表達(dá)水平在建模后3 h和6 h升高，9 h達(dá)高峰，12 h和24 h下降。與建模后3 h和24 h比較，CME組9 h心肌組織IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA的表達(dá)水平均顯著增高(P<0.05)；CME組24 h心肌組織IRAK1、TRAF6及AUF1 mRNA的表達(dá)水平與建模后3 h比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

注：與建模后3 h比較，*P<0.05；與建模后24 h比較，#P<0.05。

3 討 論

CME是急性冠狀動(dòng)脈綜合征及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療過程中的常見并發(fā)癥，目前無論是藥物還是直接機(jī)械血栓清除術(shù)等措施均不能顯著改善患者近期或遠(yuǎn)期預(yù)后。關(guān)于CME 致心功能損傷的機(jī)制，近年研究表明心肌炎癥反應(yīng)在CME致心功能損傷中發(fā)揮重要作用。CME發(fā)生后，心肌細(xì)胞因微循環(huán)障礙導(dǎo)致壞死、繼發(fā)炎癥反應(yīng)以及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等促炎癥因子分泌明顯增加，并與心功能損傷密切相關(guān)[1-2]。此外有研究證實(shí)通過抑制核因子-кB活化減弱CME致心肌炎癥可顯著改善心功能[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)心肌炎癥相關(guān)指標(biāo)和心功能改變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[8]，因此，本研究假手術(shù)組僅選取6 h作為觀察點(diǎn)。本研究中，心肌組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組未見明顯心肌微梗死灶，而CME組出現(xiàn)微梗死灶和炎癥反應(yīng)，提示本研究模型制備成功。

IRAK1和TRAF6是炎癥信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)調(diào)節(jié)分子，可誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β等促炎癥因子產(chǎn)生[3-4]；有研究發(fā)現(xiàn)，在急性心肌梗死大鼠的心肌組織中TRAF6表達(dá)明顯增高[9]。AUF1作為首個(gè)被純化及克隆的AU堿基富集區(qū)結(jié)合蛋白，可通過與mRNA 3′端未翻譯區(qū)上ARE的結(jié)合從而調(diào)控目標(biāo)mRNA降解及蛋白質(zhì)生成，近年來研究發(fā)現(xiàn)，心肌肥大和心功能衰竭時(shí)AUF1表達(dá)明顯增高[5]；此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明AUF1基因敲除小鼠由于調(diào)節(jié)目標(biāo)mRNA降解能力受損，使TNF-α和IL-1β等促炎癥因子過度表達(dá)，導(dǎo)致嚴(yán)重感染性休克[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，CME后6 h心肌組織IRAK1、TRAF6 和AUF1表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)，提示IRAK1、TRAF6 和AUF1可能參與CME后心肌炎癥反應(yīng)。因此我們推測(cè)CME后心肌組織IRAK1和TRAF6表達(dá)增多，導(dǎo)致TNF-α、IL-1β等促炎癥因子分泌增加，而AUF1反應(yīng)性升高，通過與TNF-α、IL-1β等促炎癥因子mRNA 3′端未翻譯區(qū)域上的AU堿基富集區(qū)結(jié)合，加速其mRNA降解，從而抑制促炎因子表達(dá)，減輕心肌炎癥。

研究表明，CME后心肌組織TNF-α表達(dá)水平呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)的變化，并與心功能的變化呈明顯的負(fù)相關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示，CME組建模后9 h心肌組織IRAK1、TRAF6及AUF1表達(dá)水平較建模后3 h與24 h明顯升高，而3 h與24 h表達(dá)水平無明顯差異，CME后心肌組織IRAK1、TRAF6 和AUF1表達(dá)呈現(xiàn)出的這一時(shí)間變化規(guī)律與TNF-α表達(dá)變化規(guī)律基本吻合，說明CME后心肌炎癥呈動(dòng)態(tài)改變，可能通過IRAK1、TRAF6及AUF1調(diào)控TNF-α等促炎癥因子表達(dá)實(shí)現(xiàn)。這提示CME后心肌組織3 h出現(xiàn)炎癥并隨時(shí)間逐漸加重，9 h炎癥達(dá)到高峰，12 h炎癥消退，24 h后炎癥反應(yīng)減輕至3 h水平。

綜上所述，IRAK1、TRAF6和AUF1在CME后心肌組織中高表達(dá)，并呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間變化規(guī)律。該規(guī)律揭示了CME后炎癥反應(yīng)的動(dòng)態(tài)演變過程，為臨床干預(yù)CME后心肌炎癥的時(shí)間選擇提供了參考。

[1] Li J,Zhang H,Zhang C.Role of inflammation in the regulation of coronary blood flow in ischemia and reperfusion:mechanisms and therapeutic implications[J].J Mol Cell Cardiol,2012,52(4):865-872.

[2] Li L,Zhao X,Lu Y,et al.Altered expression of pro- and anti-inflammatory cytokines is associated with reduced cardiac function in rats following coronary microembolization[J].Mol Cell Biochem,2010,342(1-2):183-190.

[3] Gottipati S,Rao NL,Fung-Leung WP.IRAK1:a critical signaling mediator of innate immunity[J].Cell Signal,2008,20(2):269-276.

[4] Jakus PB,Kalman N,Antus C,et al.TRAF6 is functional in inhibition of TLR4-mediated NF-κB activation by resveratrol[J].J Nutr Biochem,2013,24(5):819-823.

[5] Moore AE,Chenette DM,Larkin LC,et al.Physiological networks and disease functions of RNA-binding protein AUF1[J].Wiley Interdiscip Rev RNA,2014,5(4):549-564.

[6] 馬國(guó)添,曾志羽,吳 海,等.改良冠狀動(dòng)脈介入技術(shù)建立豬冠狀動(dòng)脈微栓塞動(dòng)物模型[J].天津醫(yī)藥,2014,42(6):551-553.

[7] Li S,Zhong S,Zeng K,et al.Blockade of NF-kappaB by pyrrolidine dithiocarbamate attenuates myocardial inflammatory response and ventricular dysfunction following coronary microembolization induced by homologous microthrombi in rats[J].Basic Res Cardiol,2010,105(1):139-150.

[8] Su Q,Li L,Zhou Y,et al.Induction of myocardial PDCD4 in coronary microembolization-related cardiac dysfunction:evidence from a large-animal study[J].Cell Physiol Biochem,2014,34(2):533-542.

[9] Sun Y,Huang J,Song K.BET protein inhibition mitigates acute myocardial infarction damage in rats via the TLR4/TRAF6/NF-κB pathway[J].Exp Ther Med,2015,10(6):2 319-2 324.

[10]Lu JY,Sadri N,Schneider RJ.Endotoxic shock in AUF1 knockout mice mediated by failure to degrade proinflammatory cytokine mRNAs[J].Genes Dev,2006,20(22):3 174-3 184.

Expressions and significance of interleukin-1 receptor-associated kinase 1,tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 and AU-rich element RNA-binding factor 1 mRNA in Bama miniature pig with coronary microembolization

LINShi-yun,ZENGZhi-yu,MAGuo-tian,WUHai,XIABing-hui,RUANXiang

(DepartmentofGeriatricCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore the dynamic changes and significance of interleukin-1 receptor-associated kinase 1(IRAK1),tumor necrosis factor receptor-associated factor 6(TRAF6) and AU-rich element RNA-binding factor 1(AUF1) expressions in the Bama miniature pig with coronary microembolization(CME).Methods A total of 30 Bama miniature pigs were divided into sham group(n=5) and CME group(n=25).CME group was induced by injection of microspheres into left anterior descending artery through micro-catheter,and the sham group was injected with the same volume of normal saline.At 3,6,9,12 and 24 hours after modeling,CME group was equally divided into 5 subgroups for observation.The miniature pigs in the sham group were observed at 6 hours after modeling.The changes of myocardial tissues in each group were observed using optical microscope,and the expressions of myocardial IRAK1 mRNA,TRAF6 mRNA and AUF1 mRNA were determined in each group.Results At 6 hours after modeling,the endovascular microspheres and micro-infarction around were found in CME group.Compared with the sham group,the expression levels of IRAK1 mRNA,TRAF6 mRNA and AUF1 mRNA increased significantly in CME group at 6 hours after modeling(P<0.05).In CME group,the expression levels of IRAK1 mRNA,TRAF6 mRNA and AUF1 mRNA increased significantly at 3 and 6 hours after modeling,reached the maximum level at 9 hours after modeling,and then decreased at 12 and 24 hours after modeling.In CME group,the expression levels of myocardial IRAK1 mRNA,TRAF6 mRNA and AUF1 mRNA at 9 hours after modeling significantly increased compared with the expression levels at 3 and 24 hours after modeling(P<0.05).Conclusion IRAK1 mRNA,TRAF6 mRNA and AUF1 mRNA are overexpressed in the myocardium after CME,and appear obvious time variation.

Coronary microembolization,Interleukin-1 receptor-associated kinase 1,Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,AU-rich element RNA-binding factor 1,Bama miniature pig

廣西醫(yī)療衛(wèi)生適宜技術(shù)研究與開發(fā)課題(S201303-01)；廣西醫(yī)科大學(xué)青年科學(xué)基金(GXMUYSF201213)

林士云(1985～)，男，在讀碩士研究生，研究方向：心血管疾病。

馬國(guó)添(1975～)，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：心血管疾病，E-mail：drguotianma@163.com。

R 543.31

A

0253-4304(2016)05-0619-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.05.05

2016-01-07

2016-03-15)