抗巨噬細胞移動抑制因子單抗對潰瘍性結腸炎小鼠治療效果及炎癥因子水平的影響▲

張啟芳 王柏濤 鄭 奕 邱小芬 張海蓮 李西融

(1 廣西壯族自治區南溪山醫院消化內科，桂林市 541002， E-mail：zhangqifang-gl@163.com；

2 桂林醫學院研究生學院，桂林市 541004；3 廣西壯族自治區南溪山醫院病理科，桂林市 541002)

論著·基礎研究

抗巨噬細胞移動抑制因子單抗對潰瘍性結腸炎小鼠治療效果及炎癥因子水平的影響▲

張啟芳1王柏濤2鄭 奕1邱小芬3張海蓮1李西融3

(1 廣西壯族自治區南溪山醫院消化內科，桂林市 541002， E-mail：zhangqifang-gl@163.com；

2 桂林醫學院研究生學院，桂林市 541004；3 廣西壯族自治區南溪山醫院病理科，桂林市 541002)

目的 探討抗巨噬細胞移動抑制因子(MIF)單抗對潰瘍性結腸炎(UC)小鼠治療效果及炎癥因子水平的影響。方法 選取30只雄性BALB/c小鼠，分為正常對照組、UC模型組、抗MIF單抗組各10只，以5%葡聚糖硫酸鈉誘導建立小鼠UC模型，建模后抗MIF單抗組采用抗MIF單抗腹腔注射給藥。給藥期間觀察各組小鼠一般情況并進行疾病活動指數(DAI)評分、大腸大體損傷評分及組織學評分。建模后第8天檢測血清MIF、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)濃度。結果 與正常對照組比較，UC模型組及抗MIF單抗組小鼠DAI評分、大腸大體損傷評分及組織學評分均明顯增高(P<0.05)；與UC模型組比較，抗MIF單抗組DAI評分、大腸大體損傷評分及組織學評分均明顯下降(P<0.05)；與正常對照組相比，UC模型組及抗MIF單抗組MIF、TNF-α和IL-6濃度顯著升高(P<0.05)；與UC模型組相比，抗MIF單抗組MIF、TNF-α和IL-6濃度降低(P<0.05)。結論 抗MIF單抗能有效地抑制UC小鼠血清炎癥因子的水平，對UC的治療有一定的效果。

潰瘍性結腸炎；抗巨噬細胞移動抑制因子單抗；巨噬細胞移動抑制因子；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-6；療效；小鼠

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種主要累及結腸和直腸黏膜及黏膜下層的腸道慢性非特異性炎性疾病，常反復發作，并逐漸加重。UC的病因及發病機制至今尚未明確[1]，目前認為其發病與遺傳、環境、免疫、精神、腸道菌群失調等多因素有關，而與促炎因子和抗炎因子的平衡失調相關的免疫調節在UC發病中居主導地位[2]。目前針對UC的治療，臨床多選用糖皮質激素、氨基水楊酸制劑、免疫抑制劑等，通過干預炎癥因子間的平衡失調，在一定程度緩解UC患者的病情進展，但復發率較高，副作用明顯，多數患者需終身治療。因此現階段探尋治療UC的理想方法極其必要，亦是當前研究領域的熱點。

巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)最初在炎癥性疾病中被發現，廣泛存在于人體組織中，是第一個被發現的具有多種生物學功能的炎性趨化細胞因子，可以抑制巨噬細胞的游走和移動，同時具有促炎作用。有學者發現MIF作為促炎因子參與炎癥性腸病的發病[3]，我們的前期研究也證實MIF參與UC的發病，且其可能是反映UC活動的指標，控制MIF的產生可能有治療UC作用[4]。本實驗采用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導建立小鼠UC模型，探討抗MIF單抗是否能夠通過抑制UC小鼠血清中MIF及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素(interleukin-6，IL-6)等炎癥因子水平，從而減緩UC的發生發展，為其臨床治療提供新的靶標。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級雄性BALB/c小鼠30只，鼠齡8～9周，體質量(24±2)g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK(湘)2011-0003。桂林醫學院實驗動物中心(清潔級)飼養，溫度(20±4)℃，濕度45%～60%，通風良好，光照隨晝夜浮動，飼養環境符合本實驗要求。適應性喂養1周，自由飲水。1周后采用隨機數字表達將小鼠分為正常對照組、UC模型組、抗MIF單抗組，每組10只。

1.2 藥品與試劑 葡聚糖硫酸鈉(MW36000-50000)，美國MP Biomedicals生物醫學公司生產；抗MIF單抗，重慶探生科技有限公司生產(產品貨號：FAB20140001)；小鼠MIF 酶聯免疫吸附試劑盒(產品貨號：CSB-E07292m)與IL-6 酶聯免疫吸附試劑盒(產品貨號：CSB-E04640r)購自武漢華美生物工程有限公司；小鼠TNF-α酶聯免疫吸附試劑盒(產品貨號：EMC104.96)，購自北京欣博盛生物科技有限公司；尿糞隱血測試盒(產品貨號：C027)，南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器與設備 Allegra 64R高速冷凍離心機購自美國Beckman Coulter公司；QL-901渦旋混合機由江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司生產；M200全波段酶標儀由瑞士Tecan公司生產；LRH-150B生化培養箱由廣東省醫療器械廠生產。

1.4 模型制備及藥物干預 正常對照組自由飲水，其余兩組每日飲用5% DSS溶液，連續7 d，以建立模型；各組小鼠每日均正常進食鼠糧。抗MIF單抗(4 mg/ml)與生理鹽水按1 ∶3體積比稀釋后，分別于建模開始后1 d、2 d、4 d、6 d，對單抗組小鼠腹腔注射給藥，每次0.2 ml/只，1次/d，其余兩組未注射抗MIF單抗。

1.5 標本收集及測定 于建模后第8天小鼠眼球取血，室溫下靜置1 h后，5 000 r/min離心5 min，取上清后于-80℃保存待測。嚴格按照酶聯免疫吸附測定試劑盒說明書，檢測小鼠血清MIF、TNF-α、IL-6濃度。

1.6 療效評價

1.6.1 小鼠一般情況：建模及給藥期間，每天定時稱量體重，觀察各組小鼠應激反應、精神狀態、毛色、糞便性狀、有無便血等。

1.6.2 疾病活動指數(disease activity index，DAI)評分：建模后1～7 d每日定時對各組小鼠稱量體重，觀察糞便性狀，聯苯胺法檢測糞便隱血后，根據Cooper的經典評分方法[5]進行DAI評分，取7 d評分的平均值進行比較。評分標準見表1。

表1 DAI評分標準

注：DAI評分=(體重下降評分+糞便性狀評分+便血評分)/3，分值范圍：0～4分。

1.6.3 大腸大體損傷評分：建模后第8天將所有小鼠處死，取正常對照組小鼠大腸遠端組織，其余兩組取小鼠炎癥及潰瘍嚴重的大腸組織。大腸大體損傷按以下標準[6]進行評分：0分，大腸黏膜無損傷；1分，大腸黏膜充血；2分，潰瘍面積≤受損面積的25%；3分，潰瘍面積25%～50%；4分，潰瘍面積≥50%。留取炎癥及潰瘍嚴重的大腸組織2 mm×10 mm，予10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，蘇木精- 伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。光學顯微鏡下觀察并按大腸組織學評分標準[7]進行評分，見表2。組織學損傷程度采用炎癥、病變深度、隱窩破壞及病變范圍評分的乘積表示。

表2 大腸組織學評分標準

1.7 統計學分析 采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，計量資料以(x±s)表示，多組間均數的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠一般情況 正常對照組小鼠毛色柔順，反應靈敏，精神活躍，體重不同程度增加，無便血和腹瀉；UC模型組小鼠毛色雜亂、毛發干枯，體重明顯下降，精神萎靡，反應遲緩，便血嚴重；抗MIF單抗組小鼠毛色雜亂程度與體重下降幅度不及模型組明顯，精神良好。

2.2 各組小鼠DAI評分 UC模型組DAI評分明顯高于抗MIF單抗組及正常對照組(P<0.05)；抗MIF單抗組小鼠DAI評分亦高于正常對照組(P<0.05)。見表3。

2.3 各組小鼠的大腸大體損傷情況 肉眼觀察，對照組小鼠大腸黏膜無充血、無出血點，腸壁光滑，血管網清晰可見；UC模型組大腸黏膜充血水腫、色澤暗淡，局部可見糜爛或潰瘍，管壁僵硬；抗MIF單抗組小鼠大腸黏膜充血水腫明顯、有較多小出血點，顏色更加暗淡，其范圍、程度均較模型組減輕。UC模型組大腸大體損傷評分明顯高于抗MIF單抗組及正常對照組(P<0.05)，抗MIF單抗組小鼠評分亦高于正常對照組(P<0.05)，見表3。

2.4 大腸HE染色組織學評分 對照組小鼠的大腸黏膜及黏膜下層結構完整、無缺損，上皮細胞排列整齊，腺體規則，漿膜層無充血；模型組大腸黏膜上皮明顯糜爛，固有層大部分腺體結構破壞，可見肉芽組織形成，固有層及黏膜下層大量炎癥細胞浸潤；單抗組大腸黏膜上皮無明顯糜爛，腺體規則、整齊，血管內見紅細胞聚集一起，呈充血現象，固有層有炎癥細胞浸潤，但是其數量及浸潤深度比模型組輕。見圖1。UC模型組大腸組織學評分明顯高于抗MIF單抗組及正常對照組(P<0.05)，抗MIF單抗組小鼠評分亦高于正常對照組(P<0.05)，見表3。

圖1 大腸組織HE染色情況(HE染色×100)

注：A為對照組，B為UC模型組，C為抗MIF單抗干預組。

表3 小鼠DAI評分、大腸大體損傷及大腸組織學評分(x±s，分)

注：各指標中，兩兩比較均P<0.05。

2.5 各組小鼠MIF、TNF-α、IL-6濃度比較 UC模型組及抗MIF單抗組小鼠血清MIF、TNF-α、IL-6的濃度明顯高于正常對照組(P<0.05)；抗MIF單抗組小鼠血清MIF、TNF-α、IL-6濃度低于UC模型組(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠血清MIF、TNF-α、IL-6的濃度(x±s，pg/ml)

注：各指標中，兩兩比較均P<0.05。

3 討 論

UC是炎癥性腸病中較常見的一種類型，歐洲及北美為主要好發區域[8]。近年來伴隨我國經濟的飛速發展以及國民飲食習慣的改變等諸多因素，我國UC發病率呈現逐年上升態勢[9]，已成為常見的消化系統病種之一，因此受到廣泛關注。目前UC確切的發病機制及相關致病因素尚不明確，但目前國內外學者普遍達成共識，認為促炎因子和抗炎因子的平衡失調致使機體免疫調節失衡在UC的發病中起到重要的作用，因而針對免疫方面治療UC的研究日益深入。MIF作為近年發現的多效能細胞因子，在機體內廣泛存在，參與多種疾病的炎癥反應過程，尤以在炎癥反應性疾病及惡性腫瘤等的病程演進中呈顯著性表達[10]。國內外研究表明，在UC患者的血清中，TNF-α、IL-6等促炎因子的表達水平明顯增高，且增高的水平和病情嚴重程度呈正相關[11]。而我們的前期研究已證實，UC中MIF可以激發TNF-α、IL-6等炎性介質的釋放，此類炎性介質又可反向作用于MIF刺激其釋放，從而可正性調控炎癥反應的發生，加重病情，因此MIF被認為是TNF-α、IL-6等促炎因子的上游調控因子[12-13]，在炎癥反應中具有重要作用。英夫利昔單抗在UC的臨床治療中已取得一定療效[14]，但仍有一部分病人治療效果并不理想，所以，尋找對UC治療更為有效的生物制劑已成為當前該領域的研究熱點。

目前炎癥性腸病動物模型制備方法主要有化學藥物誘導法和基因法，其中化學藥物誘導法是由三硝基苯磺酸、DSS、惡唑酮等誘導而成的動物模型。鑒于DSS模型制作的簡單易行，成功率高，重復性好，癥狀、結腸肉眼病變和組織學改變均與人類UC相似，且可人為地反復以DSS刺激，產生類似人類UC急性期和緩解期的變化，已成為研究UC發病機制和藥物療效較為理想的方法。本研究選用5% DSS誘導成功建立了UC急性期的動物模型，通過小鼠的一般情況、DAI評分、結腸組織的大體損傷評分及HE染色結果的顯微鏡下觀察確立了UC模型的成功建立。

本研究中，與UC模型組比較，應用抗MIF單抗干預治療后小鼠的精神狀態、體重變化、便血程度、腹瀉次數、毛發雜亂程度等表現均有所改善，DAI評分、結腸組織的大體損傷評分、組織學評分均降低(P<0.05)，表明抗MIF單抗不僅有助于改善UC小鼠的癥狀，亦對大腸的大體及病理學損傷有所緩解，有利于UC小鼠結腸黏膜炎癥的好轉或愈合。此外，抗MIF單抗組血清MIF、TNF-α、IL-6等促炎因子的表達水平較UC模型組也有不同程度的下降(P<0.05)，這與國外研究結果相符[15-16]。這表明抗MIF單抗能抑制UC小鼠MIF及其他炎癥因子的釋放，干預降低UC血清的炎癥因子水平，從而調節炎癥因子間的平衡，以達到機體的免疫平衡穩態，減輕炎癥反應，改善UC的臨床表現及減輕大腸黏膜的損傷程度，進而緩解UC的病情進展。其可能的作用機制是抗MIF單抗通過直接作用于UC中主要促炎因子的上游調控因子MIF本身，而阻斷其異常表達，減輕巨噬細胞的聚集，降低UC促炎因子的誘導產生，且相關促炎因子可進一步減少對MIF的刺激分泌，從而對UC病情的進展起到很好的控制作用。

本實驗從UC小鼠模型中促炎因子在血清中表達水平的直觀變化著眼，對抗MIF單抗對小鼠UC的治療作用及發揮作用的可能路徑進行了初步探討，肯定了抗MIF單抗對UC治療的確切療效，但是對抗MIF單抗治療作用的具體機制尚需進一步研究。

[1] Siggers RH,Hackam DJ.The role of innate immune-stimulated epithelial apoptosis during gastrointestinal inflammatory diseases[J].Cell Mol Life Sci,2011,68(22):3 623-3 634.

[2] 王怡薇,張會會,王彥禮,等.黃芩湯對潰瘍性結腸炎大鼠 NF-κBp65 調控作用研究[J].藥學學報,2015,50(1):21-27.

[3] Ohkawara T,Miyashita K,Nishihira J,et al.Transgenic over-expression of macrophage migration inhibitory factor renders mice markedly more susceptible to experimental colitis[J].Clin Exp Immunol,2005,140(2):241-248.

[4] 張啟芳,邱小芬,張翠萍,等.巨噬細胞移動抑制因子在炎癥性腸病發病中的作用[J].世界華人消化雜志,2008,16(15):1 645-1 648.

[5] Cooper HS,Murthy SN,Shah RS,et al.Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis[J].Lab Invest,1993,69(2):238-249.

[6] Ekstr?m GM.Oxazolone-induced colitis in rats:effects of budesonide,cyclosporin A,and 5-aminosalicylic acid[J].Scand J Gastroenterol,1998,33(2):174-179.

[7] Dieleman LA,Palmen MJ,Akol H,et al.Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium(DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines[J].Clin Exp Immunol,1998,114(3):385-391.

[8] Al-Mofarreh MA,Al-Mofleh IA.Emerging inflammatory bowel disease in saudi outpatients:a report of 693 cases[J].Saudi J Gastroenterol,2013,19(1):16-22.

[9] Prideaux L,Kamm MA,De Cruz PP,et al.Inflammatory bowel disease in Asia:a systematic review[J].J Gastroenterol Hepatol,2012,27(8):1 266-1 280.

[10]Giannice R,Erreni M,Allavena P,et al.Chemokines mRNA expression in relation to the Macrophage Migration Inhibitory Factor(MIF) mRNA and Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF) mRNA expression in the microenvironment of endometrial cancer tissue and normal endometrium:a pilot study[J].Cytokine,2013,64(2):509-515.

[11]張超賢,秦詠梅.潰瘍性結腸炎患者血清腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-8水平變化及其臨床意義[J].西安交通大學學報:醫學版,2009,30(5):646-647.

[12]張啟芳,梁志海,唐國都,等.巨噬細胞移動抑制因子在急性壞死性胰腺炎肺損傷中的表達及白介素-10 的干預作用[J].中國現代醫學雜志,2008,18(19):2 795-2 797,2 801.

[13]王柏濤,張啟芳,邱小芬,等.抗巨噬細胞移動抑制因子單抗對潰瘍性結腸炎小鼠發病的干預機制研究[J].安徽醫科大學學報,2016,51(1):31-35.

[14]譚曉燕,毛靖偉,王英德.回顧性分析潰瘍性結腸炎115例[J].世界華人消化雜志,2014,22(33):5 188-5 192.

[15]de Jong YP,Abadia-Molina AC,Satoskar AR,et al.Development of chronic colitis is dependent on the cytokine MIF[J].Nat Immunol,2001,2(11):1 061-1 066.

[16]Ohkawara T,Nishihira J,Takeda H,et al.Amelioration of dextran sulfate sodium-induced colitis by anti-macrophage migration inhibitory factor antibody in mice[J].Gastroenterology,2002,123(1):256-270.

Effects of anti-macrophage migration inhibitory factor antibody on efficacy and inflammatory factors in mice with ulcerative colitis

ZHANGQi-fang1,WANGBai-tao2,ZHENGYi1,QIUXiao-fen3,ZHANGHai-lian1,LIXi-rong3

(1DepartmentofGastroenterology,NanxishanHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Guilin541002,China; 2GraduateSchool,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China; 3DepartmentofPathology,NanxishanHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Guilin541002,China)

Objective To investigate the effects of anti-macrophage migration inhibitory factor(MIF) antibody(Ab) on efficacy and inflammatory factors in mice with ulcerative colitis(UC).Methods Thirty BALB/c male mice were enrolled and divided into normal control group,UC model group and anti-MIF Ab group,with 10 mice in each group.UC model was established using 5% dextran sulfate sodium in mice.After the modeling,the anti-MIF Ab group was administered transabdominally the anti-MIF Ab.During the period of drug administration,the general situation,disease activity index(DAI) score,gross injury score and histological score of large intestine were evaluated in each group.On the 8th day after modeling,the serum concentrations of MIF,tumor necrosis factor-(TNF-α),interleukin-6(IL-6) were detected.Results Compared to the normal control group,the DAI score,gross injury score and histological score of large intestine were significantly higher in the UC model group or anti-MIF Ab group(P<0.05).Compared to the UC model group,the DAI score,gross injury score and histological score of large intestine were significantly lower in the anti-MIF Ab group(P<0.05).Compared to the normal control group,the concentrations of MIF,TNF-α and IL-6 remarkably increased in the UC model group or anti-MIF Ab group(P<0.05).Compared to the UC model group,the concentrations of MIF,TNF-α and IL-6 decreased in the anti-MIF Ab group(P<0.05).Conclusion Anti-MIF Ab has a strongly inhibitory effect on the levels of serum inflammatory factors in mice with UC and is effective on the treatment of UC to a degree.

Ulcerative colitis,Anti-macrophage migration inhibitory factor antibody,Macrophage migration inhibitory factor,Tumor necrosis factor-α,Interleukin-6,Efficacy,Mouse

廣西醫療衛生重點科研課題(重2011018)；廣西桂林市科學研究與技術開發計劃(科技攻關20140120-7-2)

張啟芳(1968～)，女，博士，教授，碩士研究生導師，主要研究方向：炎癥性腸病的基礎與臨床研究。

R 574.621

A

0253-4304(2016)05-0615-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.05.04

2015-12-14

2016-03-02)