原花青素B2及黃曲霉毒素B1對人胚胎肝細(xì)胞細(xì)胞色素P450亞酶1A2、3A4活力及基因表達(dá)的影響▲

范秋玉 馬玲玲 肖德強(qiáng) 黃東萍 賈 亮 劉丹丹 鄧祥發(fā) 潘 劍 張勇勝 魯 力

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南寧市 530021，E-mail：1220514140@qq.com；2 廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與學(xué)校衛(wèi)生所，南寧市 530021；廣西醫(yī)科大學(xué)3 護(hù)理學(xué)院，4 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧市 530021；5 廣西醫(yī)科大學(xué)一附院營養(yǎng)科，南寧市 530021)

論著·基礎(chǔ)研究

原花青素B2及黃曲霉毒素B1對人胚胎肝細(xì)胞細(xì)胞色素P450亞酶1A2、3A4活力及基因表達(dá)的影響▲

范秋玉1馬玲玲1肖德強(qiáng)1黃東萍1賈 亮2劉丹丹3鄧祥發(fā)4潘 劍4張勇勝5魯 力1

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南寧市 530021，E-mail：1220514140@qq.com；2 廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與學(xué)校衛(wèi)生所，南寧市 530021；廣西醫(yī)科大學(xué)3 護(hù)理學(xué)院，4 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧市 530021；5 廣西醫(yī)科大學(xué)一附院營養(yǎng)科，南寧市 530021)

目的 探討原花青素B2(PC-B2)與黃曲霉毒素B1(AFB1)對人胚胎肝細(xì)胞L-02細(xì)胞色素P450(CYP)亞酶1A2、3A4活力及其基因表達(dá)的影響。方法 L-02細(xì)胞體外培養(yǎng)后分空白對照、溶劑對照、AFB1染毒、PC-B2處理和PC-B2干預(yù)共5組，其中PC-B2處理分為3個亞組，分別采用3、10、30 μg/ml PC-B2干預(yù)，PC-B2干預(yù)分為3各亞組，分別采用3、10、30 μg/ml PC-B2預(yù)處理12 h后，再加不同濃度PC-B2與AFB1干預(yù)24 h。測定各組細(xì)胞的CYP1A2、CYP3A4酶活力以及CYP1A2、CYP3A4基因的mRNA表達(dá)水平；測定細(xì)胞存活率，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果 與空白對照組相比，AFB1染毒組細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，胞膜結(jié)構(gòu)不清，漂浮細(xì)胞增多，CYP1A2、CYP3A4酶活力及其mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與空白對照組相比，3、10 μg/ml PC-B2處理組細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)無明顯變化，但30 μg/ml PC-B2處理組的細(xì)胞存活率升高，CYP1A2、CYP3A4酶活力下降(P<0.05)。與AFB1染毒比較，30 μg/ml PC-B2干預(yù)組的細(xì)胞存活率升高(P<0.05)，各濃度PC-B2干預(yù)組的細(xì)胞CYP1A2、CYP3A4酶活力及基因表達(dá)均降低(P<0.05)，且干預(yù)濃度越高，CYP1A2、CYP3A4酶活力及基因表達(dá)越低(P<0.05)。結(jié)論 AFB1能明顯誘導(dǎo)肝細(xì)胞CYP1A2、CYP3A4酶活力及其mRNA表達(dá)，促使肝細(xì)胞凋亡，PC-B2干預(yù)可促進(jìn)肝細(xì)胞生長并抑制上述CYP二個亞酶的活力及其基因表達(dá)，提示PC-B2可能通過抑制I相代謝酶CYP對AFB1的活化而對肝細(xì)胞有良好保護(hù)作用。

原花青素B2； 黃曲霉毒素B1； 人胚胎肝細(xì)胞；細(xì)胞色素P450酶

黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類致癌物，是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)。AFT主要污染糧油食品、動植物食品等，尤其在我國南方，由于其地理氣候條件，食物如玉米、花生、大米及其制品更易受黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)污染[1-2]。AFT的危害性在于對人及動物的肝臟組織有明顯破壞作用，嚴(yán)重時可導(dǎo)致肝癌甚至死亡[3]。AFB1為前致癌物，在人體內(nèi)可代謝活化為終致癌物，其代謝過程受各種代謝酶功能狀態(tài)的影響[4]。原花青素廣泛存在于葡萄籽、柏樹、松樹、銀杏中，近年來，已有研究表明原花青素具有多種生物活性，對酒精、對乙酰氨基酚等多種化學(xué)物質(zhì)引起的肝損傷均具有一定保護(hù)作用[5-6]。進(jìn)一步研究原花青素對AFB1所致的肝損傷是否具有干預(yù)作用及其機(jī)制，對于AFB1高污染地區(qū)人群的肝癌預(yù)防有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料 原花青素B2(procyanidin B2，PC-B2)、AFB1、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(美國Sigma公司)；人胚胎肝細(xì)胞L-02(華中科技大學(xué))；RPIM 1640培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco公司)；GENMED細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP)亞酶1A2和3A4活性熒光定量檢測試劑盒(上海杰美基因，批號：1-423517-10、8-251531-10)；RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(日本Takara，批號：AA1302-1、AK3001、AK6801)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 (1)復(fù)蘇L-02細(xì)胞，用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，正常培養(yǎng)3代后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)細(xì)胞分組處理：將細(xì)胞分為空白對照組、AFB1染毒組、PC-B2處理組(包括3、10、30 μg/ml PC-B2 3個亞組)及PC-B2干預(yù)組(包括3、10、30 μg/ml PC-B2 3個亞組)，同時設(shè)置溶劑對照組(0.5% DMSO)。AFB1染毒組細(xì)胞用含30 μg/ml AFB1的培養(yǎng)基孵育24 h；PC-B2處理組分別用含3、10、30 μg/ml PC-B2的培養(yǎng)基孵育24 h；PC-B2干預(yù)組先分別用含3、10、30 μg/ml PC-B2的培養(yǎng)基孵育12 h，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗后，再加相應(yīng)濃度PC-B2與30 μg/ml AFB1共孵育24 h。孵育在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

1.3 四甲基偶氮唑鹽法測定細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長的細(xì)胞，以5×104/ml的濃度接種于96孔板，每孔100 μl，待細(xì)胞貼壁后，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理，各組設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，先將細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，隨后各孔加入10 μl 四甲基偶氮唑鹽，孵育4 h后，吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，37℃恒溫震蕩孵育10 min，490 nm波長處用Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀測A值。定義空白對照組細(xì)胞存活率為100%，其余各組細(xì)胞存活率計算公式如下：細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A空白對照×100%。

1.4 細(xì)胞CYP1A2、CYP3A4酶活性測定 (1)樣本制備：取對數(shù)生長的細(xì)胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，每瓶4 ml，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理。培養(yǎng)結(jié)束后，PBS洗3次，細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮離下來，PBS稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到1×106/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成分。3 000 r/m離心20 min，仔細(xì)收集上清為待測樣品。二喹啉甲酸法測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度為100～200 μg/100 μl。(2)細(xì)胞CYP1A2酶活性測定：按照CYP1A2活性熒光定量檢測試劑盒說明書，用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長530 nm，散發(fā)波長590 nm處測量樣品的熒光強(qiáng)度。(3)細(xì)胞CYP3A4酶活性測定：實(shí)驗(yàn)步驟按照CYP3A4活性熒光定量檢測試劑盒說明書，用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長410 nm，散發(fā)波長538 nm處測量樣品的熒光強(qiáng)度。

1.5 細(xì)胞CYP1A2、CYP3A4的mRNA表達(dá)水平測定 取對數(shù)生長的細(xì)胞以1×105個/孔的濃度接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，1×PBS洗3次，各孔加入1 ml RNAiso Plus提取RNA。應(yīng)用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)擴(kuò)增目的基因。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性3 s，60℃退火及延伸30 s，進(jìn)行45個循環(huán)。以泛素(ubiquitin，UBC)作為內(nèi)參照。RNA提取質(zhì)量及PCR產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖-TBE膠鑒定。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計量資料以(x±s)表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PC-B2和AFB1對L-02肝細(xì)胞存活率及形態(tài)的影響 空白對照組正常L-02細(xì)胞呈三角形或多邊形，貼壁生長，細(xì)胞飽滿，邊界清晰，細(xì)胞有重疊性生長，幾乎沒有脫落。3 μg/ml、10 μg/ml PC-B2處理組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，與空白對照比，30 μg/ml PC-B2處理組細(xì)胞存活率升高(P<0.05)，約升高11.8%。用30 μg/ml AFB1染毒24 h后，細(xì)胞密度減小，胞膜結(jié)構(gòu)不清，培養(yǎng)基中漂浮細(xì)胞增多，L-02細(xì)胞存活率較空白對照組降低(P<0.05)，約降低31%。3 μg/ml、10 μg/ml、3 010 μg/ml的PC-B2處理組細(xì)胞存活率均高于空白對照組及溶劑對照組(P<0.05)，提示PC-B2干預(yù)后能提高細(xì)胞存活率；且30 μg/ml PC-B2干預(yù)組細(xì)胞存活率高于AFB1染毒組(P<0.05)。見表2及圖1。

表2 各組細(xì)胞存活率比較(x±s，%)

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與溶劑對照組比較，bP<0.05；與AFB1染毒組比較，cP<0.05。

2.2 PC-B2和AFB1對L-02肝細(xì)胞CYP1A2、CYP3A4酶活性的影響 與空白對照組相比，PC-B2處理組CYP1A2、CYP3A4酶活力均有降低，但僅30 μg/ml濃度處理組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。30 μg/ml AFB1染毒組L-02細(xì)胞CYP1A2、CYP3A4酶活力較空白對照組及溶劑對照組明顯升高(P<0.05)，而PC-B2干預(yù)組CYP1A2、CYP3A4酶活力AFB1染毒組降低(P<0.05)，且隨干預(yù)濃度增大，酶活性越低(P<0.05)。見表3。 注：A 空白對照組；B 3 μg/ml PC-B2處理組；C 10 μg/ml PC-B2處理組；D 30 μg/ml PC-B2處理組：E 溶劑對照組；F 30 μg/ml AFB1染毒組；G 3 μg/ml PC-B2干預(yù)組；H 10 μg/ml PC-B2干預(yù)組；I 30 μg/ml PC-B2干預(yù)組。

圖1 各組L-02細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(40×)

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與溶劑對照組比較，bP<0.05；與AFB1染毒組比較，cP<0.05；#各濃度PC-B2干預(yù)組兩兩比較，P均<0.05。

2.3 PC-B2和AFB1對L-02肝細(xì)胞CYP1A2、CYP3A4基因表達(dá)的影響 與空白對照組及溶劑對照組比較，AFB1作用24 h后L-02細(xì)胞CYP1A2、CYP3A4基因表達(dá)升高(P<0.05)。PC-B2干預(yù)組細(xì)胞CYP1A2、CYP3A4基因表達(dá)較AFB1染毒組明顯降低，且隨PC-B2干預(yù)濃度CYP1A2、CYP3A4基因表達(dá)越低(P<0.05)。PC-B2處理組基因表達(dá)水平有所升高，但差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 PC-B2和AFB1對L-02肝細(xì)胞CYP1A2、CYP3A4基因表達(dá)的影響(n=2，x±s)

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與溶劑對照組比較，bP<0.05；與AFB1染毒組比較，cP<0.05；#各濃度PC-B2干預(yù)組兩兩比較，P均<0.05。

3 討 論

AFB1為前致癌物，在沒有經(jīng)過代謝活化之前無致癌性，它須通過體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化形成活性中間體才具有致癌性。AFB1的代謝活化主要發(fā)生在肝臟，通過I相代謝的主要酶系CYP的代謝形成有毒性和致癌性的AFB1-8，9-環(huán)氧化物(AFB1-8，9-epoxide，AFBO)。CYP有多個亞族，促進(jìn)AFB1代謝形成AFBO最重要的CYP亞酶是CYP1A2和CYP3A4[7-8]，它們在肝臟中含量不僅多且活性高，同時，CYP還可被多種化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)，使其代謝活性進(jìn)一步增強(qiáng)。

近年對食物中活性成分的研究結(jié)果顯示，很多植物化學(xué)物具有多種生物學(xué)功能[9]，天然食品中某些活性成分通過調(diào)節(jié)CYP活性而產(chǎn)生的防癌作用也逐步引起人們的關(guān)注。鄭海平等[10]用銀杏葉提取物EGb761干預(yù)AFB1誘發(fā)大鼠肝癌的過程，結(jié)果表明EGb761可抑制大鼠肝組織CYP3A4活性，從而減少前致癌物的代謝活化，降低AFB1致癌性及其化學(xué)性肝損傷達(dá)到保護(hù)肝臟的作用。原花青素是一種在植物中廣泛存在的多酚類化合物，對酒精、CCl4等多種外源性物質(zhì)引起的肝細(xì)胞損傷有一定保護(hù)作用[5，11]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低、中兩個劑量PC-B2單純處理對肝細(xì)胞存活率及CYP酶活力未見有明顯影響，而高劑量PC-B2處理能明顯增加肝細(xì)胞存活率、降低CYP1A2和CYP3A4酶活力(P<0.05)，相應(yīng)基因表達(dá)有所下降，但差別無統(tǒng)計學(xué)意義。這提示原花青素PC-B2具有良好的保護(hù)肝細(xì)胞的作用，可促進(jìn)肝細(xì)胞生長。而采用AFB1染毒后肝細(xì)胞CYP1A2、CYP3A4酶活力及基因表達(dá)均升高(P<0.05)，提示AFB1在肝細(xì)胞內(nèi)代謝，這可致AFBO形成增多，同時培養(yǎng)基中漂浮細(xì)胞增多，細(xì)胞密度減小，胞膜結(jié)構(gòu)不清，也提示肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷。同時本實(shí)驗(yàn)以原花青素中活性最強(qiáng)的PC-B2干預(yù)L-02細(xì)胞CYP酶對AFB1的活化，結(jié)果顯示PC-B2干預(yù)后細(xì)胞存活率有所恢復(fù)，凋亡細(xì)胞減少，CYP1A2、CYP3A4酶活力及基因表達(dá)相較AFB1染毒組明顯降低(P<0.05)，且隨PC-B2干預(yù)濃度增大作用越明顯。由此可見，PC-B2可能抑制或延緩AFB1誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的進(jìn)程。

綜上所述，AFB1能明顯誘導(dǎo)肝細(xì)胞CYP1A2、CYP3A4酶活力及其mRNA表達(dá)，促使肝細(xì)胞凋亡；PC-B2干預(yù)可促進(jìn)肝細(xì)胞生長并抑制上述CYP兩個亞酶的活力及其基因表達(dá)。這提示PC-B2可能通過抑制Ⅰ相代謝酶CYP對AFB1的活化而對肝細(xì)胞有良好保護(hù)作用。

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Effects of procyanidin B2 and aflatoxin B1on activity and gene expressions of cytochrome P450 1A2 and 3A4 in human embryonic stem cells

FANQiu-yu1,MALing-ling1,XIAODe-qiang1,HUANGDong-ping1,JIALiang2,LIUDan-dan3,DENGXiang-fa4,PANJian4,ZHANGYong-sheng5,LULi1

(1SchoolofPublicHealth,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;2NutritionandSchoolHealth-Center,GuangxiCenterforDiseasePreventionandControl,Nanning530021,China;3SchoolofNursing,4SchoolofBasicMedicine,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;5DepartmentofNutrition,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the effects of procyanidin B2(PC-B2) and aflatoxin B1(AFB1) on the activity and gene expressions of the cytochrome P450(CYP) 1A2 and CYP3A4 in human embryonic stem cells(L-02).Methods After culture in-vitro,L-02 cells were divided into 5 groups including blank control group,solvent control group,AFB1exposure group,PC-B2 exposure group and PC-B2 intervention group.PC-B2 exposure group was divided into 3 subgroups,and these 3 subgroups were treated with PC-B2 with the concentrations of 3,10 and 30 μg/ml separately for 12 hours.PC-B2 intervention group was divided into 3 subgroups,and these 3 subgroups were treated with PC-B2 with the concentrations of 3,10 and 30 μg/ml separately for 12 hours,then were treated with PC-B2 with different concentrations and AFB1for 24 hours.The enzyme activities and mRNA expressions of CYP1A2 and CYP3A were detected in each group.And the survival rate of the cells was also measured.The morphological changes of the cells were observed by fluorescent microscope.Results Compared to blank control group,the cell survival rate decreased(P<0.05),the structure of cytomembrane was unclear and floating cells increased,CYP1A2 and CYP3A4 enzyme activities and mRNA expression levels increased significantly in AFB1exposure group(P<0.05).No significant changes in the indices of 3 μg/ml and 10 μg/ml PC-B2 exposure groups were observed compared to blank control group.But the cell survival rate increased,CYP1A2 and CYP3A4 enzyme activities decreased significantly in 30 μg/ml PC-B2 exposure group compared to blank control group(P<0.05).Compared to AFB1exposure group,the cell survival rate of 30 μg/ml PC-B2 intervention group increased(P<0.05),CYP1A2 and CYP3A4 enzyme activities and mRNA expressions decreased significantly in all PC-B2 intervention groups(P<0.05).And CYP1A2 and CYP3A4 enzyme activities and mRNA expressions decreased with the increase of concentration for intervention(P<0.05).Conclusion AFB1can induce the enzyme activities and mRNA expressions of CYP1A2 and CYP3A4 enzyme,and can promote the apoptosis of hepatic cells.Intervention with PC-B2 can promote the growth of liver cells,and can inhibit the activity and gene expression of the two CYP subenzymes.The results indicate that the protective effect of PC-B2 on hepatic cells might be mediated by inhibiting the activation of AFB1by CYP.

Procyanidin B2,Aflatoxin B1,Human embryonic stem cells,Cytochrome P450 enzyme

國家自然科學(xué)基金(31360383)

范秋玉(1986～)，女，在讀碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生。

魯力(1960～)，男，碩士，教授，研究方向：營養(yǎng)與健康、食品安全，E-mail：luligx@163.com。

R 329.2

A

0253-4304(2016)05-0601-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.05.01

2016-01-26

2016-04-11)