多重聚合酶鏈反應(yīng)體系的建立及其在診斷急性胰腺炎繼發(fā)感染中的應(yīng)用價值▲

徐偉松 倪潤洲

(1 江蘇省南通市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科，南通市 226002，E-mail：xws71@sina.com；2 南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南通市 226001)

論著·臨床研究

多重聚合酶鏈反應(yīng)體系的建立及其在診斷急性胰腺炎繼發(fā)感染中的應(yīng)用價值▲

徐偉松1倪潤洲2

(1 江蘇省南通市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科，南通市 226002，E-mail：xws71@sina.com；2 南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南通市 226001)

目的 建立多重聚合酶鏈反應(yīng)(m-PCR)體系，并探討其在診斷急性胰腺炎(AP)繼發(fā)感染中的應(yīng)用價值。方法 選取185例AP患者，輕癥AP 140例，重癥AP 45例。建立一種同時擴增9種腸道常駐菌特異性目的基因的m-PCR體系，于患者發(fā)病7～14 d內(nèi)采用該技術(shù)檢測患者外周血中9種腸道常駐菌的目的基因，診斷患者有無繼發(fā)性細菌感染；同時抽取外周血或腹腔穿刺液進行培養(yǎng)，以培養(yǎng)結(jié)果為金標準，評價m-PCR對AP繼發(fā)感染的診斷效能。結(jié)果 建立的m-PCR體系可同時檢測9種腸道常駐致病菌。185例AP患者m-PCR診斷34例為重癥胰腺炎患者繼發(fā)感染，8例為輕癥胰腺炎患者繼發(fā)感染；培養(yǎng)法診斷26例為重癥胰腺炎患者繼發(fā)感染，5例為輕癥胰腺炎患者繼發(fā)感染。m-PCR診斷重癥胰腺炎繼發(fā)感染的靈敏性為92.3%，特異性為47.37%，陽性預(yù)測值70.59%，陰性預(yù)測值81.82%，準確度為73.33%；m-PCR檢查輕癥胰腺炎繼發(fā)感染的靈敏性為80%，特異性為97.04%，陽性預(yù)測值50%，陰性預(yù)測值99.24%，準確度為96.43%。結(jié)論 m-PCR適用于監(jiān)測重癥胰腺炎患者繼發(fā)細菌感染，該方法準確度高，方便快捷，可作為對重癥胰腺炎患者繼發(fā)細菌性感染的診斷方法。

急性胰腺炎；繼發(fā)性感染；多重聚合酶鏈反應(yīng)；診斷

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床常見的危重急癥，腸道細菌移位造成的繼發(fā)性感染是其患者死亡的最常見原因[1-2]。有研究表明，預(yù)防性靜脈應(yīng)用抗生素并不能降低重癥AP患者繼發(fā)感染的發(fā)生率[3]。目前診斷胰腺炎繼發(fā)胰腺及胰腺周圍感染的主要方法是血培養(yǎng)和超聲或CT引導(dǎo)下取穿刺液培養(yǎng)[4]。多重聚合酶鏈式反應(yīng)(multiplex polymerase chain reaction，m-PCR)是在常規(guī)PCR 基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)，其在同一個PCR反應(yīng)體系中加入多對引物，分別擴增不同的目的基因。本研究建立一種同時擴增9種腸道常駐菌(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌病原菌)特異性目的基因的m-PCR體系，通過該技術(shù)檢測AP患者血標本了解繼發(fā)感染情況，以評價該技術(shù)用于診斷AP繼發(fā)感染的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年1月至2015年10月期間南通市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科收治的AP患者185例，診斷符合《中國AP診治指南(草案)》[5]中的相關(guān)標準，均處于繼發(fā)感染高危期，病程>1周<2周。其中男性96例，女性89例，年齡42～92(59±10)歲；輕癥AP140例，重癥AP45例。于患者發(fā)病7～14 d內(nèi)抽取外周血行血培養(yǎng)，腹腔滲出液較多的重癥AP患者行CT引導(dǎo)下腹腔穿刺引流，并取穿刺液培養(yǎng)，以培養(yǎng)結(jié)果為診斷繼發(fā)性感染的標準。

1.2 主要儀器與試劑 超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司),電子恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，Centrifuge臺式高速離心機(德國Eppendorf公司)，冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，PCR儀(美國ABI公司)，DYY-6C電泳儀(北京六一儀器有限公司)，電泳凝膠成像系統(tǒng)(上海BioSense公司)，酶標儀(美國Bio-Rad公司)，4℃冰箱(日本Sanyo公司)，-80℃超低溫冰箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)，旋渦振蕩器XW-80A(上海青浦瀘西儀器公司)，移液器(Eppendorf公司)。質(zhì)粒小抽試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，DP118140606]，瓊脂糖膠回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，GK2043-200]，Taq DNA聚合酶/pfu DNA聚合酶(南通麥杰生物科技有限公司)，脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP；南通麥杰生物科技有限公司)，瓊脂糖(Sigma公司)，DL2000 ladder(南通麥杰生物科技有限公司)。

1.3 m-PCR體系建立 (1)針對9種腸道常駐菌(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌病原菌)設(shè)計并篩選9對特異性引物，測序及引物合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，引物序列見表1。首先建立單重PCR檢測體系，對標準菌株(根據(jù)GeneBank相關(guān)菌株基因編碼構(gòu)建而成，南通麥杰生物科技有限公司完成)目的基因DNA進行擴增，以10 ng/μl的鮭魚精DNA為溶劑，梯度稀釋細菌標準菌株基因組DNA至104、103、102、10個拷貝數(shù)，確定檢測的特異性和靈敏度，并與測序驗證對照判斷其同源性，從而為建立一種同時擴增9種腸道常駐菌的m-PCR檢測體系的建立奠定基礎(chǔ)。(2)于患者發(fā)病7～14 d內(nèi)抽外周血10 ml。行m-PCR檢測。采用堿液加熱裂解法對患者血標本提取革蘭陽性菌和革蘭陰性菌基因組DNA[6]，經(jīng)特異性引物擴增，分別采用針對3組細菌(第1組：金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、嗜麥芽窄食單胞菌病原菌；第2組：屎腸球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌；第3組：大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、鮑曼不動桿菌)的三重實時熒光PCR行m-PCR，以獲取特異性目的基因擴增產(chǎn)物。建立m-PCR反應(yīng)體系，根據(jù)影響m-PCR的主要因素(引物濃度、dNTP濃度、Taq酶濃度、Mg2+濃度)優(yōu)化反應(yīng)條件，確定50 μl反應(yīng)體系各組分的量如下：模板DNA各2 μl，上、下游引物(20 pmol/μl)各1 μl，10×PCR 緩沖液5 μl，4 μl dNTP(2.5 mmol/L)，2 μl Mg2+(25 mmol/L)，0.5 μl Taq 酶(5 U/μl)，其余用滅菌ddH2O補足，總體積 50 μl。PCR 擴增條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，54℃退火 40 s，72℃延伸45 s，共進行 35 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。感染陽性的標準以≥最低下限檢測拷貝數(shù)為準，檢測出1種以上常駐菌種陽性則診斷為繼發(fā)感染。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。以外周血液培養(yǎng)或腹腔穿刺液培養(yǎng)結(jié)果為繼發(fā)感染的金標準，計算m-PCR法診斷胰腺炎繼發(fā)感染的敏感度、特異度性、準確度、陽性預(yù)測值與陰性預(yù)測值等診斷效能指標。

2 結(jié) 果

2.1 9種細菌標準菌株目的基因PCR擴增產(chǎn)物 9種標準菌株目的基因經(jīng)PCR擴增后均產(chǎn)生單一條帶，產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果相符。見圖1。

表1 9種腸道常駐菌特異性目的基因及所篩選的特異性引物

圖1 9株細菌的PCR擴增產(chǎn)物

注：1為金黃色葡萄球菌(169 bp)；2為表皮葡萄球菌(179 bp)；3為糞腸球菌(197 bp)；4為屎腸球菌(183 bp)；5為大腸埃希菌(110 bp)；6為肺炎克雷伯菌(166 bp)；7為銅綠假單胞菌(81 bp)；8為鮑曼不動桿菌(198 bp)；9為嗜麥芽窄食單胞菌病原菌(95 bp)；M為標志物DL2000。

2.2 9種細菌標準菌株目的基因PCR擴增的敏感性 9種細菌標準菌株目的基因PCR擴增后，靈敏度檢測結(jié)果顯示，大腸埃希菌的敏感性最高，檢出的下限為10個拷貝，其次為肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、銅綠假單胞菌，檢出下限為102個拷貝，再次為金黃色葡萄球菌、嗜麥芽窄食單胞菌病原菌、鮑曼不動桿菌，檢出下限為103個拷貝。見圖2。

2.3 患者血標本的細菌基因組DNA m-PCR擴增產(chǎn)物 提取患者血標本的革蘭陽性菌和革蘭陰性菌基因組DNA，并針對3組細菌的三重實時熒光PCR行m-PCR后，獲得9個特異性目的基因擴增產(chǎn)物，見圖3。

圖2 9株細菌的梯度拷貝的PCR擴增

注：2A左為大腸埃希菌，2A右為肺炎克雷伯菌，2B左為金黃色葡萄球菌，2B右為表皮葡萄球菌，2C左為糞腸球菌，2C右為屎腸球菌，2D為銅綠假單胞菌(1～4)、嗜麥芽窄食單胞菌(5～8)、鮑曼不動桿菌(9～12)。

圖3 9種腸道常駐菌m-PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

注：1：糞腸球菌(197 bp)，金黃色葡萄球菌(169 bp)，嗜麥芽窄食單胞菌病原菌(95 bp)；2：屎腸球菌(183 bp)，肺炎克雷伯菌(166 bp)，銅綠假單胞菌(81 bp)；3：鮑曼不動桿菌(198 bp)，表皮葡萄球菌(179 bp)，大腸埃希菌(110 bp)；標志物：DL2000。

2.4 m-PCR法與培養(yǎng)法細菌檢測結(jié)果比較 m-PCR法診斷34例重癥胰腺炎患者繼發(fā)感染，8例輕癥胰腺炎患者繼發(fā)感染；培養(yǎng)法診斷26例重癥胰腺炎患者繼發(fā)感染，5例輕癥胰腺炎患者繼發(fā)感染。以培養(yǎng)結(jié)果為金標準，m-PCR診斷重癥胰腺炎繼發(fā)感染的靈敏性為92.31%，特異性為47.37%，陽性預(yù)測值70.59%，陰性預(yù)測值81.82%，準確度為73.33%；以培養(yǎng)結(jié)果為金標準，m-PCR診斷輕癥胰腺炎繼發(fā)感染的靈敏性為80.00%，特異性為97.04%，陽性預(yù)測值50.00%，陰性預(yù)測值99.24%，準確度為96.43%；m-PCR法檢測重癥胰腺炎繼發(fā)感染具有較高靈敏度。見表2、表3。

表2 m-PCR法與培養(yǎng)法細菌診斷 重癥胰腺炎繼發(fā)感染結(jié)果比較

表3 m-PCR法與培養(yǎng)法細菌診斷 輕癥胰腺炎繼發(fā)感染結(jié)果比較

3 討 論

AP是以全身性炎癥反應(yīng)綜合征為病理生理特征的急性全身性炎癥性疾病，以局部臟器發(fā)病、全身多臟器功能受損為表現(xiàn)。胰腺的壞死呈不可逆、進行性發(fā)展，是消化系統(tǒng)最常見的危重急癥，其致殘率、病死率高，嚴重危害廣大人民群眾的身心健康。AP患者繼發(fā)性感染細菌絕大多數(shù)來源于腸道細菌易位，通常稱為“二次打擊”。腸道細菌易位與內(nèi)毒素血癥可加重全身反應(yīng)綜合征、誘發(fā)多器官功能障礙綜合征與多器官功能衰竭[7-8]。最近有學(xué)者報告部分急性壞死性胰腺炎患者的感染還未被發(fā)現(xiàn)其病情已出現(xiàn)惡化[9]。因此，如何早期診斷重癥胰腺炎并發(fā)感染、指導(dǎo)應(yīng)用抗生素、判斷病情嚴重程度以及預(yù)后，是迫切需要解決的問題。

臨床醫(yī)生及時準確地診斷AP患者繼發(fā)細菌感染具有一定的難度。對AP患者預(yù)防性使用抗生素存在巨大的爭議，且效益成本比較低[10]。此外，濫用廣譜抗生素會增加菌株耐藥和二重感染的概率，增加患者經(jīng)濟負擔，延長住院時間，增加病死率[11-13]。目前臨床上通常采用的調(diào)節(jié)患者腸內(nèi)營養(yǎng)狀態(tài)、改善免疫力及置管引流等治療方法，在一定程度上有利于縮短病程、減少并發(fā)癥的發(fā)生[14-17]。目前，臨床上對于AP患者繼發(fā)細菌感染的診斷，更多的是基于癥狀、炎癥性標記物、腹部CT等臨床資料的綜合判斷[18-20]。有研究表明血清降鈣素原作為一種評估細菌感染的炎癥性標記物，已在AP并發(fā)感染及其他感染性疾病的診斷中廣泛應(yīng)用[21-22]。但是，最近有薈萃分析結(jié)果顯示降鈣素原在急診科診斷細菌感染的敏感度為76%，特異度70%，具有中度的診斷價值；此外，在嚴重的燒傷、大型手術(shù)后，降鈣素原在體內(nèi)會暫時增加，導(dǎo)致了結(jié)果的假陽性[23]。單純的癥狀體征和固有的生物標記物都不能對疾病作出全面精確地評估，探索更有臨床價值的生物標記是近年來國內(nèi)外學(xué)者的研究方向。臨床工作中迫切需要探索和研究新的檢測方法來判斷重癥胰腺炎患者是否存在繼發(fā)性細菌感染，從而指導(dǎo)抗生素的合理應(yīng)用。

m-PCR能夠在提高通量的同時節(jié)省樣品、降低成本，它需要優(yōu)化dNTP、MgCl2、聚合酶和鹽的濃度，一般來說，最多能在同一個管中同時檢測到5個目標片段。本研究以“二次打擊”學(xué)說為理論依據(jù)，根據(jù)前期研究方法，以腸道常駐致病菌為基礎(chǔ)建立m-PCR方法[24]，檢測重癥胰腺炎患者發(fā)病7～14 d內(nèi)的外周血液標本或穿刺液標本。結(jié)果顯示，以血培養(yǎng)或穿刺液培養(yǎng)結(jié)果為金標準，m-PCR診斷重癥胰腺炎繼發(fā)感染的靈敏性為92.3%，特異性為47.37%，陽性預(yù)測值70.59%，陰性預(yù)測值81.82%，準確度為73.33%；m-PCR診斷輕癥胰腺炎繼發(fā)感染的靈敏性為80.00%，特異性為97.04%，陽性預(yù)測值50.00%，陰性預(yù)測值99.24%，準確度為96.43%。其中m-PCR法診斷重癥胰腺炎繼發(fā)感染具有較高靈敏度，提示m-PCR技術(shù)對于診斷重癥胰腺炎繼發(fā)性感染有較好的臨床價值，從而可指導(dǎo)臨床抗生素的使用，縮短重癥胰腺炎患者抗生素使用時間和住院天數(shù)，減少因抗生素過度使用導(dǎo)致的細菌耐藥和二重感染的發(fā)生。本研究中，m-PCR對對輕癥胰腺炎的繼發(fā)感染的診斷敏感性稍低，但其特異性、準確度較高，這可能與輕癥AP繼發(fā)感染的發(fā)生率較低、真陰性個體數(shù)絕對值高有關(guān)，同時也與本研究樣本量較少有關(guān)。

總之，AP患者存在腸道細菌移位是患者繼發(fā)感染的主要感染源，在早期階段通過干預(yù)如腸內(nèi)營養(yǎng)，可對重癥胰腺炎患者全身炎癥反應(yīng)綜合征、多器官功能障礙綜合征等并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展起到一定的延遲和緩解作用，從而改善重癥胰腺炎預(yù)后。m-PCR對于診斷重癥胰腺炎并發(fā)細菌感染性具有較高的應(yīng)用價值，對于準確評估患者感染狀態(tài)具有重要的指導(dǎo)意義。

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Establishment of a multiplex polymerase chain reaction system and its application value for diagnosis of infection secondary to acute pancreatitis

XUWei-song1,NIRun-zhou2

(1DepartmentofGastroenterology,theSecondPeople′sHospitalofNantong,Nantong226002,China;2DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,China)

Objective To establish a multiplex polymerase chain reaction(m-PCR),and to explore the application value of m-PCR for the diagnosis of infection secondary to acute pancreatitis(AP).Methods A total of 185 patients with AP were enrolled including 140 with mild acute pancreatitis(MAP) and 45 with severe acute pancreatitis(SAP).A m-PCR system specifically amplifying the target genes of 9 intestinal resident floras was established.Then the target genes of 9 intestinal resident floras in the peripheral blood were detected in all patients within 7-14 days of onset for diagnosis of secondary bacterial infection.The peripheral blood or puncture liquid of abdominal cavity was obtained for culture.The diagnostic efficacy of m-PCR for infection secondary to AP was assessed on the basis of golden criteria of culture result.Results The established m-PCR system could detect 9 intestinal resident floras at the same time.Thirty-four patients with SAP and 8 patients with MAP were diagnosed as secondary infection by m-PCR method.Twenty-six patients with SAP and 5 patients with MAP were diagnosed as secondary infection by culture method.The sensitivity,specificity,positive predictive value,negative predictive value and accuracy of m-PCR method for infection secondary to SAP were 92.3%,47.37%,70.59%,81.82% and 73.33% respectively.The sensitivity,specificity,positive predictive value,negative predictive value and accuracy of m-PCR method on the basis of culture result for infection secondary to MAP were 80%,97.04%,50%,99.24% and 96.43% respectively.Conclusion m-PCR is applicable for monitoring the secondary bacterial infection in patients with SAP.This method is accurate and convenient,and can be an approach for the diagnosis of secondary bacterial infection in patients with SAP.

Acute pancreatitis,Secondary infection,Multiplex polymerase chain reaction,Culture

江蘇省南通市科技局社會事業(yè)科技創(chuàng)新與示范項目(HS13937)

徐偉松(1971～)，男，本科，主任醫(yī)師，研究方向：肝胰疾病基礎(chǔ)與臨床。

倪潤洲(1957～)，男，博士，主任醫(yī)師、教授，研究方向：消化系疾病，E-mail：13951315559@163.com。

R 576.1

A

0253-4304(2016)11-1492-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.11.04

2016-05-31

2016-08-07)