壯族家系Krüppel樣因子6基因多態性與肝癌易感性的關系▲

魏斐斐 廖 燕 趙瑞強 王洪學 謝裕安

(1 廣西醫科大學附屬腫瘤醫院實驗研究部，南寧市 530021，E-mail：weifeifei20071@163.com；2 廣西醫科大學生物化學與分子生物學教研室，南寧市 530021)

論著·基礎研究

壯族家系Krüppel樣因子6基因多態性與肝癌易感性的關系▲

魏斐斐1廖 燕1趙瑞強2王洪學1謝裕安1

(1 廣西醫科大學附屬腫瘤醫院實驗研究部，南寧市 530021，E-mail：weifeifei20071@163.com；2 廣西醫科大學生物化學與分子生物學教研室，南寧市 530021)

目的 探討Krüppel樣因子6(KLF6)基因rs7634位點多態性與壯族人群肝細胞癌(HCC)易感性的關系。方法 選取廣西扶綏縣壯族人群10個正常對照家系(40例)及20個肝癌家系(79例)，后者包括HCC患者20例及其未患HCC的直系親屬59例。運用質譜方法檢測KLF6基因rs7634位點基因型及等位基因的分布頻率；應用非條件logistic回歸分析不同基因型及等位基因與HCC發病的關系。結果 在肝癌患者、肝癌家系親屬和正常家系人群中，KLF6基因rs7634位點TT基因型的分布頻率分別為40.00%、54.24%和87.50%，TA基因型的分布頻率分別為60.00%、42.37%和12.50%，AA基因型的分布頻率分別為0、3.39%和0，T等位基因的分布頻率分別為70.00%、75.42%和93.75%，A等位基因的分布頻率分別為30.00%、24.58%和6.25%。在肝癌患者及正常家系人群中，攜帶TA基因型個體發生肝癌的風險是TT基因型個體的10.5倍(P<0.05)，攜帶A等位基因個體發生肝癌的風險是T基因型個體的6.429倍(P<0.05)；在肝癌患者及肝癌家系直系親屬中，攜帶TA基因型個體發生HCC的風險是TT基因型個體的1.667倍，攜帶A基因型個體發生肝癌的風險是T基因型個體的1.257倍，但差異均無統計學意義(P>0.05)。結論 KLF6基因rs7634多態性與壯族家系肝癌易感性關系密切，攜帶TA基因型或A等位基因可能是HCC發生的危險因素。

肝細胞癌；Krüppel 樣因子6；單核苷酸多態性；家系；易感；壯族；廣西；扶綏縣

肝癌是世界上最常見和惡性程度最高的腫瘤之一。據統計，2012年世界范圍內有782 500新增肝癌病例和745 500死亡病例，中國的新增病例和死亡病例約占了50%[1]。除了環境等外在綜合致癌因素外，肝癌的發生和發展很大程度上與個體間基因型的遺傳多態性密切相關。有研究結果顯示肝癌存在明顯的家族聚集傾向，這提示遺傳因素在肝癌發病中具有重要作用[2]。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)作為第3代遺傳標記，反映了個體間的遺傳差異，是研究肝癌遺傳易感性的重要物質。Krüppel樣因子6(Krüppel-like factor 6，KLF6)為Krupple樣家族成員之一，是最新發現的抑癌基因，其參與細胞的分化、發育、生長信號的轉導、細胞增殖、凋亡和血管形成等過程。研究發現，KLF6基因的缺失、突變與許多腫瘤的發生發展密切相關[3]。目前關于KLF6基因突變在肝癌中的作用的研究結果尚不一致[4-6]。本研究采用質譜技術對廣西扶綏縣肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)家系與正常對照家系的KLF6基因rs7634位點基因多態性進行檢測與分型，以探討KLF6基因多態性與HCC遺傳易感性的關系，從而為HCC的發病機制、診斷、及預防提供實驗參考依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 10個正常家系及20個肝癌家系均來自肝癌高發地區廣西扶綏縣壯族人群。肝癌患者均經病理組織學診斷為HCC，于2003年1月至2011年10月期間在廣西醫科大學附屬腫瘤醫院進行手術，術前均未行放射、化學或生物治療。20個肝癌家系由肝癌患者20例及其直系親屬59例組成，共79例，其中經病史采集確認肝癌患者的直系親屬中至少有1人確診為HCC，而納入直系親屬是指與肝癌患者有直接血緣關系的未患肝癌的親屬，包括一級親屬(父母、子女、兄弟姐妹)和二級親屬(叔伯、堂兄弟、堂姐妹)。79例肝癌家系中，男45例，女34例，年齡16～86歲，中位年齡44歲；HbsAg(+) 50例，HbsAg(-)29例；甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)(+)14例，AFP(-)65例； 吸煙(≥10支/d )17例，不吸煙(<10支/d)60例，其余2例信息缺失；飲酒(≥100 g/d)64例，不飲酒(<100 g/d)12例，其余3例信息缺失。10個正常家系由在扶綏縣醫院進行健康體檢的人群組成，與肝癌家系組無血緣關系，體檢結果均健康，無肝炎病史、腫瘤病史及遺傳病史，共40例，其中男26例，女14例，年齡16～85歲，中位年齡47歲；吸煙(≥10支/d)15例，不吸煙(<10支/d)25例，飲酒(≥100 g/d)17 例，不飲酒(<100 g/d)23例。正常對照家系與肝癌家系間年齡、性別、吸煙史等基本資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究按照國家人類基因組研究倫理準則進行，所有入選者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器：血液/細胞/組織DNA提取試劑盒購于北京天根生物科技有限公司，iPLEX反應試劑、384-well SpectroCHIP生物芯片、質譜檢測儀及點樣儀均購自美國Sequenom公司，Hotstart Taq酶購自美國Agena Bioscience公司，384孔雙頭PCR儀購自美國ABI公司，PCR擴增引物和單堿基延伸引物購自深圳華大基因公司。

1.2.2 DNA提取及KLF6基因檢測：采用血液/細胞/組織DNA提取試劑盒，對20例肝癌患者手術切除的癌組織標本、59例肝癌家系直系親屬及40例正常對照家系靜脈血液標本提取DNA，提取的DNA置于-20℃冰箱保存備用，所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。所提取的DNA用于分析KLF6基因型的基因組DNA：先通過PCR擴增目標序列，然后加入SNP序列特異延伸引物，在SNP位點上，延伸 1個堿基。將制備的樣品分析物與芯片基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管，將樣品轉移到SpectroCHIP芯片后，即可放入質譜儀進行檢測，每個檢測點只需 3～5 s，全自動分析。

1.2.3 引物設計及合成： 應用Assay Designer 3.1 Software(美國Sequenom公司)設計引物，由深圳華大基因公司合成引物。與任何一個SNP位點相對應的是一條延伸引物和兩條PCR擴增引物。擴增引物1-上游 5′-ACGTTGGATGGTGGTCATCTCATCTCATGG-3′；擴增引物1-下游 5′-ACGTTGGATGCCTTGTGGTTAGCAAGACTG-3′；延伸引物序列5′-TCTCATCTCATGGTATACTCCTT-3′。

1.2.4 PCR擴增及芯片點樣： 首先使用Hotstart Taq酶，在384孔板上常規進行40個循環以擴增待測片段，然后將2 μl蝦堿性酸化酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP；Sequenom公司)消化液(雙蒸水1.53 μl，HME緩沖液0.17 μl，SAP 0.474 U)加入到PCR產物中，消化反應37℃ 60 min、85℃ 10 min，以除去未用盡三磷酸脫氧核苷。 然后根據Sequenom程序進行引物單堿基延伸反應和延伸產物樹脂除鹽純化反應。最后將檢測樣品從384孔反應板轉移到表面覆蓋基質的MassARRAY SpectroCHIP芯片[7]。

1.2.5 飛行質譜技術檢測SNP位點：采用Mass ARRAY時間飛行質譜技術(美國Sequenom公司)進行KLF6的SNP基因分型；實驗結果及分型數據采用TYPER4.0軟件分析，均由Sequenom實驗平臺(深圳華大基因公司)支持。SNP分型是根據引物延伸反應產物質譜峰的位置確定其分子質量，從而得出SNP分型結果。同一種顏色可以對應2個或3個峰值，分別為SNP位點的延伸引物峰及兩個等位基因峰，若該位點屬于純合子，則僅存在1個等位基因峰，若為雜合子，則存在2個等位基因峰[7]。

1.3 統計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。應用擬合優度χ2檢驗分析各組基因型分布的Hardy-Weinberg遺傳平衡，以判斷所調查對象是否具有人群代表性。采用非條件logistic回歸分析法計算不同等位基因及基因型與HCC發病的關系。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 基因型檢測結果 KLF6基因rs7634位點存在TT、TA、AA3種基因型。119例樣本中，TT基因型75例、TA基因型42例、AA基因型2例。見圖1。

A rs7634基因型TT

B rs7634基因型TA

C rs7634基因型AA

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 在正常對照家系及肝癌家系中，TT、TA、AA基因型頻率觀察值與期望值之間吻合度均較好(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，提示各組均具有人群代表性。見表1。

表1 KLF6基因rs7634位點 基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

2.3 KLF6基因rs7634位點多態性與HCC發病的關系 KLF6基因rs7634位點TT基因型在肝癌患者、肝癌家系親屬和正常家系人群中的分布頻率分別為40.00%(8/20)、54.24%(32/59)和87.50%(35/40)；TA基因型在肝癌患者、肝癌家系和健康對照家系中的分布頻率分別為60.00%(12/20)、42.37%(25/59)和12.50%(5/40)；AA基因型在肝癌患者、肝癌家系和健康對照家系中的分布頻率分別為0(0/20)、3.39%(32/59)和0(0/40)。非條件logistic回歸分析結果顯示，在肝癌患者及正常家系人群中，攜帶TA基因型個體發生HCC的風險是TT基因型個體的10.5倍(P<0.05)，見表2；在肝癌患者及肝癌家系直系親屬中，攜帶TA基因型個體發生HCC的風險是TT基因型個體的1.667倍，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。KLF6基因rs7634位點T等位基因在肝癌患者、肝癌家系親屬和正常家系人群中的分布頻率分別為70.00%(28/40)、75.42%(89/118)和93.75%(75/80)；KLF6基因rs7634位點A等位基因在肝癌患者、肝癌家系親屬和正常家系人群中的分布頻率分別為30.00%(12/40)、24.58%(29/118)和6.25%(5/80)。非條件logistic回歸分析結果顯示，在肝癌患者及正常家系人群中，攜帶A等位基因個體發生HCC的風險是T基因型個體的6.429倍(P<0.05)，見表2；在肝癌患者及肝癌家系直系親屬中，攜帶A基因型個體發生HCC的風險是T基因型個體的1.257倍，但差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表2 肝癌患者及正常家系中rs7634位點多態性與HCC發病的關系(n，%)

表3 肝癌患者及其親屬中rs7634位點多態性與HCC發病的關系(n，%)

3 討 論

肝癌是常見的消化系統腫瘤。流行病學研究結果已表明，肝癌發生的高危因素包括HBV/HCV 感染、黃曲霉毒素B1暴露、飲用水污染等[2]，但是亦有研究表明在相同的致癌因素作用下，只有少部分個體罹患肝癌，提示個體差異的遺傳易感性對于肝癌的發生具有重要作用[2]。研究表明SNP在人群中發生頻率>1%，與疾病易感性的改變密切相關[8]。KLF6屬于Krupple樣家族成員，定位于人類染色體10p15，全長約7 kb，表達產物是含283個氨基酸的蛋白，在大多數組織、器官中均有表達，是一種廣泛表達的鋅指轉錄因子。KLF6作為一種新發現的抑癌基因，參與了細胞的分化、發育、生長信號的轉導、細胞增殖、凋亡和血管形成等過程。KLF6基因含4個外顯子，第2、3外顯子通常發生突變?，F已發現，KLF6基因的缺失、突變與許多腫瘤的發生、發展密切相關，在前列腺癌[9]、肺癌[10]、結腸癌[11]、卵巢癌[12]、胃癌[13]、惡性黑色素瘤[14]及乳腺癌[15]患者中有KLF6基因不同程度的突變和缺失。

近年來對KLF6在肝癌中的研究多集中在KLF6是否發生突變的問題上，而所得研究結論不盡相同。Wang等[6]發現在所檢測的HCC組織中，49%～52%存在KLF6基因異常，包括突變或雜合性缺失。而Song等[5]檢測79例HCC患者的KLF6基因后發現，在癌組織中未見KLF6的突變基因；Boyault等[4]也報告KLF6的突變可能在HCC發生中的作用較小。單個堿基突變或SNP會導致基因異常剪接，選擇性剪接可導致KLF6產生剪接變異體，如KLF-SV1、KLF-SV2和KLF-SV3[6]。有學者發現，在肝癌中KLF-SV1 mRNA表達升高并拮抗野生型KLF6的作用[16]；KLF-SV2在肝癌中表達下降，并出現抗增殖和促凋亡的作用[17]。研究表明，KLF6基因多態性與腫瘤關系密切[18-20]。KLF6基因內含子1(IVS1-27G>A；rs3750861)SNP可增加腫瘤發生的風險，如：前列腺癌[18]、肺癌[19]。而Chen等[20]研究發現，在中國人群中KLF6 IVS1-27的AA基因型與降低胃癌的風險和胃癌分期相關。

本研究應用飛行質譜技術的方法分析了廣西扶綏地區79例肝癌家系和40例正常對照家系人群KLF6基因rs7634位點多態性，結果顯示，在肝癌患者及正常家系人群中，攜帶TA基因型個體發生肝癌的風險是TT基因型個體的10.5倍(P<0.05)，攜帶A等位基因個體發生肝癌的風險是T基因型個體的6.429倍(P<0.05)。這提示KLF6基因rs7634位點多態性與發生HCC有關，攜帶A等位基因及TA基因型是肝癌的危險因素，這與其他學者[18-19]提出的KLF6單核苷酸多態性可增加腫瘤發生風險的結論相符。

綜上所述，KLF6基因rs7634位點多態性與發生HCC有關，攜帶A等位基因及TA基因型是肝癌易感性的危險因素。但本次研究收集病例數有限，同時研究局限于廣西扶綏縣的壯族人群，故結論仍需擴大樣本例數、在不同地域及人群中進行研究以進一步證實。

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Relationship of Krüppel-like factor 6 gene polymorphism with susceptibility to hepatocellular carcinoma in family of Zhuang nationality

WEIFei-fei1,LIAOYan1,ZHAORui-qiang2,WANGHong-xue1,XIEYu-an1

(1DepartmentofExperimentalResearch,AffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;2DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore the relationship between polymorphism of Krüppel-like factor 6 (KLF6) gene locus rs7634 and the susceptibility to hepatocellular carcinoma(HCC) in family of Zhuang nationality.Methods Ten normal control families(n=40) and 20 HCC families(n=79) including 20 patients with HCC and their 59 lineal consanguinity without HCC were enrolled.All subjects were Zhuang nationality from Fusui County of Guangxi.The distribution frequencies of genotypes and alleles of KLF6 gene locus rs7634 were determined using mass spectrometry method.The relationship of different genotypes and alleles with incidence of HCC was analyzed using unconditional logistic regression model.Results Among the patients with HCC,lineal consanguinity of HCC families and persons from normal families,the frequencies of genotype TT of KLF6 gene locus rs7634 were 40.00%,54.24% and 87.50% respectively,the frequencies of genotype TA were 60.00%,42.37% and 12.50% respectively,the frequencies of genotype AA were 0,3.39% and 0 respectively,the frequencies of allele T were 70.00%,75.42% and 93.75% respectively,and the frequencies of allele A were 30.00%,24.58% and 6.25% respectively.In the patients with HCC and persons from normal family,the risk for HCC of the individuals with genotype TA was 10.5 times the risk of the individuals with genotype TT(P<0.05),and the risk for HCC of the individuals with allele A was 6.429 times the risk of the individuals with allele T(P<0.05).In the patients with HCC and lineal consanguinity of HCC families,the risk for HCC of the individuals with genotype TA was 1.667 times the risk of the individuals with genotype TT,and the risk for HCC of the individuals with allele A was 1.257 times the risk of the individuals with allele T,but no statistical differences were observed(P>0.05).Conclusion The polymorphism of KLF6 gene locus rs7634 closely correlates with susceptibility to HCC in family of Zhuang nationality.Carrying genotye TA or allele T might be the risk factors for HCC. 【Key words】 Hepatocellular carcinoma,Krüppel-like factor 6,Single nucleotide polymorphism,Family clustering,Susceptibility,Zhuang nationality,Guangxi,Fusui County

國家自然科學基金(81260320)

魏斐斐(1987～)，女，在讀博士研究生，研究方向：腫瘤基礎及臨床研究。

謝裕安(1964～)，男，博士，教授，研究方向：腫瘤免疫與基因治療研究，E-mail：gxxya@aliyun.com。

R 735.7

A

0253-4304(2016)11-1481-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.11.01

2016-05-14

2016-08-04)