重癥手足口病180例病原學(xué)檢測(cè)及腸道病毒71型基因特征分析▲

邱寶強(qiáng) 顏云盈 李 梅 夏天航

(廣西南寧市婦幼保健院兒科，南寧市 530011，E-mail：bh138@163.com)

論著·臨床研究

重癥手足口病180例病原學(xué)檢測(cè)及腸道病毒71型基因特征分析▲

邱寶強(qiáng) 顏云盈 李 梅 夏天航

(廣西南寧市婦幼保健院兒科，南寧市 530011，E-mail：bh138@163.com)

目的 探討重癥手足口病病原學(xué)特征，分析腸道病毒71型(EV71)基因型的特征。方法 重癥手足口病患兒180例，采集發(fā)病一周內(nèi)的咽拭子或肛拭子標(biāo)本，應(yīng)用實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測(cè)標(biāo)本中的腸道病毒。分別選取2014年及2015年各5例EV71檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)增基因的VP1區(qū)，測(cè)序并比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析。結(jié)果 180份標(biāo)本中腸道病毒核酸陽(yáng)性153份，陽(yáng)性率85.00%。153份陽(yáng)性結(jié)果中EV71核酸陽(yáng)性占50.3%(77/153)，柯薩奇病毒A組16型(CVA16)核酸陽(yáng)性占19.6%(30/153)，其他腸道病毒核酸陽(yáng)性占30.1%(46/153)。2014年及2015年以EV71為主，CVA16較少，兩年間病毒型別構(gòu)成比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。多元線(xiàn)性回歸分析示，擬合回歸方程：Y=2.095X1+0.462X2-0.214，式中Y為重癥病例數(shù)，X1為EV71病例數(shù)，X2為其他腸道病毒病例數(shù)。EV71數(shù)可反映99.7%重癥病例變化。不同年齡間病毒型別構(gòu)成比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。發(fā)病高峰集中在每年4～8月；發(fā)病以4歲以下兒童為主，占82.7%，尤其是1～3歲年齡段(57.8%)。EV71 VP1區(qū)與C4a基因型代表株核苷酸同源性為91.6%～92.5%，氨基酸同源性為97.5%～98.8%，親緣進(jìn)化分析顯示EV71與C4a基因型代表株處于同一分支。結(jié)論 EV71是本地區(qū)重癥手足口病患兒主要病原，且屬于C4a基因亞型。

手足口病；血清型；腸道病毒7l型 ；VP1基因

手足口病是小兒內(nèi)科常見(jiàn)傳染性疾病之一，臨床表現(xiàn)為出疹、發(fā)熱，主要病原體為腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A組16型(Coxasckie virus group A，type 16，CVA16)[1]。大部分患兒病程短，可自行愈合，預(yù)后良好。部分患兒可并發(fā)無(wú)菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、心肌炎等，甚至危及生命。其中大部分重癥死亡患兒由EV71感染引起[2]。筆者對(duì)180例重癥手足口病患兒進(jìn)行腸道病毒分離鑒定及病毒基因分析，旨在了解該病病原體分布情況及基因特征。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年1月至2015年12月在我院診斷為重癥手足口病患兒180例的標(biāo)本。重癥手足口病診斷符合《手足口病預(yù)防控制指南(2009年版)》[3]。男112例，女68例；年齡3個(gè)月至7歲。本研究經(jīng)醫(yī)院學(xué)術(shù)委員會(huì)同意批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 方法 患兒確診后3 d內(nèi)無(wú)菌采集咽拭子或肛拭子置入病毒運(yùn)送液中，送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。分別選取2014年及2015年各5例EV71檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)增基因的VP1區(qū)，測(cè)序并比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析。

1.2.1 病毒核酸提取：按照《手足口病預(yù)防控制指南(2009版)》[3]中的方法進(jìn)行標(biāo)本的采集和處理。采用Omega Viral RNA kit(美國(guó)Omega公司)提取病毒RNA。取200 μl拭子洗脫液進(jìn)行RNA的提取，提取的RNA的終體積為50 μl。

1.2.2 EV71 VP1區(qū)基因擴(kuò)增：使用PrimeScript RT reagent Kit[寶生物工程(大連)有限公司]對(duì)病毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA作為VP1區(qū)基因擴(kuò)增的模板。EV71 VP1區(qū)擴(kuò)增引物序列如下：

VP1F：AGGGTGGCAGATGTAATTGA

VP1R：CCACTCTAAAGTTGCCCACGTA

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 042 bp。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 45 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.2.3 測(cè)序與分析：對(duì)擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序。使用DNAstar和MEGA 5.0進(jìn)行DNA同源性分析和遺傳進(jìn)化分析。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)所使用的EV71病毒各基因型代表株的序列來(lái)自于GenBank。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel 2003建立數(shù)據(jù)庫(kù)，SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；組間多重比較經(jīng)Brunden法校正，以P<0.017為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單因變量和多因變量線(xiàn)性關(guān)系分析用多元線(xiàn)性回歸分析。單向有序計(jì)數(shù)資料比較采用多組獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis檢驗(yàn))，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病原學(xué)檢測(cè)情況 180份標(biāo)本中腸道病毒核酸陽(yáng)性153份，陽(yáng)性率85.00%。153份陽(yáng)性結(jié)果中EV71核酸陽(yáng)性占50.3%(77/153)，CVA16核酸陽(yáng)性占19.6%(30/153)，其他腸道病毒核酸陽(yáng)性占30.1%(46/153)，見(jiàn)表1。2014年及2015年以EV71為主伴隨其他腸道病毒，CVA16較少，兩年間病毒型別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.529，P=0.467)。

表1 手足口病重癥病例病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果(n，%)

2.2 多元線(xiàn)性回歸分析 2014～2015年病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果與重癥發(fā)生例數(shù)行多元線(xiàn)性回歸分析，CVA16病例數(shù)與重癥發(fā)生例數(shù)無(wú)線(xiàn)性關(guān)系(P>0.05)未納入回歸模型，EV71病例數(shù)和其他腸道病毒例數(shù)納入回歸模型，擬合模型檢驗(yàn)P<0.01，R2=0.999，EV71數(shù)可反映99.7%重癥病例數(shù)變化。擬合回歸方程：Y=2.095X1+0.462X2-0.214，式中Y為重癥病例數(shù)，X1為EV71病例數(shù)，X2為其他腸道病毒病例數(shù)。見(jiàn)圖1。

圖1 回歸標(biāo)準(zhǔn)化殘差p-p圖

2.3 病原學(xué)構(gòu)成時(shí)間變化 2014～2015年1、2月及12月份幾乎無(wú)發(fā)病，發(fā)病時(shí)間主要集中在4～8月份，共有127例(83.00%)。見(jiàn)圖2。

圖2 2014～2015年重癥手足口病病原構(gòu)成時(shí)間變化

2.4 不同年齡、性別病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較 在180例中男女性別比為1.65 ∶1。發(fā)病年齡主要集中于4歲以下兒童(87.2%)，尤其是1～3歲年齡段(57.8%)，5歲以上年齡組發(fā)病數(shù)急劇下降，其中以1～2歲年齡組的重癥病例兒童最多。不同年齡間病毒型別構(gòu)成比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=9.727，P=0.083)。見(jiàn)表2和圖3。

表2 180例不同年齡組病原體檢測(cè)結(jié)果(n)

圖3 各年齡組重癥病例帕累托圖

2.5 病毒分離與鑒定 采集的20例標(biāo)本，提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，通過(guò)對(duì)EV71 VP1區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳(見(jiàn)圖4)。

圖4 EV71 VP1 PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳

2.6 EV71病毒VP1區(qū)核苷酸和氨基酸序列分析 分別選取2014年及2015年各5例EV71毒株，將10株EV71毒株與GenBank上的EV71各基因型與亞型代表株的VP1區(qū)基因序列進(jìn)行比較及分析，10株EV71毒株與A、B、C型的核苷酸同源性分別為79.3%～81.5%、80.2%～83.9%、86.1%～92.5%，氨基酸同源性分別為91.2%～93.4%、94.0%～98.0%、96.7%～98.8%。與C4a亞型的同源性最高，見(jiàn)表3。

表3 EV71病毒VP1區(qū)核苷酸和氨基酸序列分析結(jié)果

2.7 EV71 VP1區(qū)基因親緣關(guān)系分析 EV71 VP1區(qū)的基因親緣關(guān)系樹(shù)顯示，10株EV71分離株與C4亞型在同一分支，屬于C4a亞型，見(jiàn)圖5。

圖5 EV71分離株與各亞型代表株在VP1區(qū)的基因進(jìn)化樹(shù)

3 討 論

引起重癥手足口病的病原型均屬小RNA病毒科腸道病毒屬，目前共發(fā)現(xiàn)20余個(gè)血清型，主要包括埃可病毒、EV71型、CVA16組4、5、7、9、10、16型以及CVB組2、5、13型，在我國(guó)以CVA16和EV71型最為常見(jiàn)[4]。重癥手足口病的病原學(xué)檢測(cè)方法主要包括雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度測(cè)定、病毒分離培養(yǎng)、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-PCR，RT-PCR)。病毒分離培養(yǎng)為病毒性疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，是應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)從傳染源或感染部位分離出病毒并鑒定血清型，但因其過(guò)程繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)，容易耽誤手足口病的早期診斷，無(wú)法滿(mǎn)足流行地區(qū)大樣本的檢測(cè)。RT-PCR技術(shù)利用腸道病毒特異性引物檢測(cè)血清標(biāo)本，以發(fā)現(xiàn)腸道病毒RNA同源的基因序列為判斷依據(jù)，具有微量、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[5]。該檢測(cè)方法克服了血清學(xué)方法和病毒分離培養(yǎng)耗時(shí)、繁雜的缺點(diǎn)，能夠在疾病流行期間同時(shí)檢測(cè)大量標(biāo)本，目前已成為快速診斷腸道病毒感染的重要手段。本文結(jié)果表明，2014～2015年重癥手足口病病原學(xué)主要是以EV71為主伴隨其他腸道病毒，CVA16較少，與其他學(xué)者[6-7]報(bào)告基本一致。

EV71是一種高度嗜中樞神經(jīng)性腸道病毒，可累及中樞系統(tǒng)的任何區(qū)域，因此除了可引發(fā)與CVA16相似的重癥手足口病、皰疹性咽峽炎等癥狀外，還導(dǎo)致中樞系統(tǒng)疾病，如腦炎、腦膜炎以及弛緩性癱瘓。1996年以前，EV71病毒主要傳播于澳大利亞和美國(guó)，1996年之后流行于亞洲[8]。我國(guó)EV71感染引起的重癥手足口病在20世紀(jì)90年代才逐漸占主導(dǎo)地位。楊洪等[9]對(duì)2008～2010 年深圳市手足口病就診情況及病原學(xué)研究結(jié)果提示EV71是主要病原體，而 CVA16的發(fā)病率逐漸降低。郁會(huì)蓮等[10]報(bào)告陜西省2008～2011年手足口病病毒以EV71型為主，占56.48%；重癥病例為0.2%～20.0%，且多發(fā)生在4～7月，年齡多為≤3 歲，男孩居多，致病體為EV71型[10]。江蘇省手足口病流行具有明顯的季節(jié)性、人群性以及地區(qū)性，引起手足口病普通病例流行的病原體主要為EV71和CVA16，且不同年份間流行優(yōu)勢(shì)株有所差別，重癥病例和死亡病例的流行優(yōu)勢(shì)毒株均為EV71[11]。本研究結(jié)果顯示，引起本地區(qū)2014～2015年重癥手足口病流行的主要病原是EV71；男性病例高于女性(男女之比為1.65 ∶1)；發(fā)病年齡主要集中于4歲以下兒童占87.2%，尤其是1～3歲年齡段占57.8%；時(shí)間分布主要集中在4～8月份，占總發(fā)病數(shù)的83.00%，與以往報(bào)告[3]相似。但不同年齡間病毒型別構(gòu)成比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示4歲以下幼童均為重癥手足口病的高危感染人群。

大量實(shí)驗(yàn)表明，腸道病毒的VP1 編碼區(qū)基因序列與病毒血清型相關(guān)，對(duì)于血清型的鑒定具有重要意義，而且該編碼區(qū)的基因序列最大的變異速率，可進(jìn)行親緣性進(jìn)化分析，用于分子流行病學(xué)研究[12-13]。本研究通過(guò)VP1編碼區(qū)核苷酸序列測(cè)定和分析，確定分離毒株的血清型，并對(duì)分離到的EV71流行株進(jìn)行基因特征分析。進(jìn)一步將從GenBank檢索到EV71各基因型和亞型的代表毒株VP1序列、全國(guó)各地近年分離的EV71病毒VP1序列，與本次分離出的EV71病毒VP1序列進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列同源性分析。結(jié)果表明，2014～2015年本地區(qū)10株EV71病毒分離株屬于C4基因亞型同一個(gè)分支 (bootstrap 值為96)；與C4a基因亞型的代表株接近，核苷酸同源性為91.6%～92.5%，而氨基酸同源性為97.5%～98.8%，與國(guó)內(nèi)報(bào)告[14]相似；與A、B基因型的差別比較大，核苷酸同源性為75.3%～81.5%，而氨基酸同源性為93.4%～99.2%；與C基因型的C1、C2、C3和C5比較，核苷酸同源性為85.3%～87.5%，而氨基酸同源性為95.1%～98.4%。

綜上所述，本地區(qū)2014～2015年重癥手足口病病原體與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)病原體類(lèi)似，主要是EV71，但仍有部分未知的病毒，尚需要我們進(jìn)一步研究。

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Etiological detection of 180 cases of severe hand-foot-mouth disease and characteristics analysis of enterovirus 71 gene

QIUBao-qiang,YANYun-ying,LIMei,XIATian-hang

(DepartmentofPediatrics,theMaternalandChildHealthHospitalofNanning,Nanning530011,China)

Objective To explore the etiological characteristics of severe hand-foot-mouth disease,and to analyze the characteristics of enterovirus 71(EV17) gene.Methods The specimens of throat swabs and anal swabs were collected from 180 children with severe hand-foot-mouth disease within one week of onset.The enterovirus of specimens was detected using real-time reverse transcription-polymerase chain reaction technology.VP1 region of gene was amplified in 5 specimens with positive EV71 from 2014 and 2015 separately.Then sequencing and comparison was conducted and the phylogenetic tree was constructed for analysis.Results Of 180 specimens,nucleic acid of enterovirus was positive in 153 specimens,accounting for 85.00%.And of 153 positive specimens,positive nucleic acid of EV71 accounted for 50.3%(77/153),positive nucleic acid of Coxsackie virus type A 16(CVA16) accounted for 19.6%(30/153),and positive nucleic acid of the other enterovirus accounted for 30.1%(46/153).EV71 was the main pathogenic virus and CAV16 was minor in 2014 and 2015,and there was no significant difference between the constituent ratios of virus type in 2014 and 2015(P>0.05).A multiple linear regression analysis revealed that the fitting regression equation:Y=2.095X1+0.462X2-0.214,Y:The number of severe cases, X1:The number of EV71 cases,X2:The number of other enterovirus cases.The number of EV71 cases could reflect the changes in 99.7% of severe cases.There was no significant difference in the constituent ratio of virus type among different age groups(P>0.05).The incidence peak was concentrated from April to August in each year.The children aged less than 4 years(82.7%) were common,especially the children aged 1 to 3 years(57.8%).The nucleotid homogeneity and amino acid homogeneity between VP1 regions of representative strains with EV71 and C4a genotypes was 91.6%-92.5% and 97.5%-98.8% respectively.The phylogenetic tree analysis showed that representative strains with EV71 and C4a genotypes were in the same branch.Conclusion EV71 is the main pathogen of children with severe hand-foot-mouth disease in the local area,and belongs to C4a subgenotype.

Hand-foot-mouth disease,Serotype,Enterovirus 71,VP1 gene

廣西南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃(20133190)

邱寶強(qiáng)(1961～)，男，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：兒童感染性疾病。

顏云盈(1966～)，女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：兒童感染性疾病和兒童重癥醫(yī)學(xué)，E-mail：nnyyy0818@sina.com。

R 725.1

A

0253-4304(2016)04-0482-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.04.10

2016-01-04

2016-03-21)