卵母細胞玻璃化凍融獲成功妊娠1例

唐永梅 韋立紅

(廣西柳州市婦幼保健院生殖助孕中心，柳州市 545001，E-mail：TYMei75@126.com)

卵母細胞玻璃化凍融獲成功妊娠1例

唐永梅 韋立紅

(廣西柳州市婦幼保健院生殖助孕中心，柳州市 545001，E-mail：TYMei75@126.com)

目的 探討玻璃化冷凍方法在冷凍保存卵母細胞中的臨床應用價值。方法 2015年3月在我中心行卵母細胞玻璃化冷凍1例,于2015年7月行玻璃化解凍，行卵胞漿內單精子注射受精，獲得胚胎后進行移植和冷凍。結果 共冷凍13枚卵母細胞，解凍后存活12枚(92.3%)，對12枚成熟卵母細胞行單精子卵漿內顯微注射，9枚(75.0%)正常受精，8枚(88.9%)卵裂，再次解凍移植獲單胎妊娠，現正在妊娠中。結論 玻璃化凍融卵母細胞是一種方便可行的方法,在特殊情況下發揮著不可替代的作用，可以獲得臨床妊娠。

體外受精胚胎移植；卵母細胞；玻璃化冷凍

卵母細胞是人類最大的單細胞，對外部環境非常敏感。卵母細胞在冷凍過程中很少能完好無損。因為減數分裂的紡錘體對溫度敏感且冷凍后透明帶變硬，所以通常采用卵胞漿內單精子顯微注射解決卵子受精。玻璃化冷凍技術可以解決卵子低存活率問題，使冷凍卵母細胞的效率大大提高。現報道我中心采用玻璃化冷凍技術冷凍的1例成功案例。

1 病例摘要

樊某，36歲，因輸卵管因素，原發不孕6年于2015年3月在我中心行體外受精胚胎移植術治療。患者基礎激素：孕酮(progesterone，P)0.51 ng/ml，雄性激素(testosterone，T)68.82 ng/dl，雌二醇(estradiol，E2)101.31 pg/ml，垂體泌乳素(prolactin，PRL)6.89 ng/ml，促卵泡生成激素(follicle-stimulating hormone，FSH)7.89 MIU/ml，促黃體素(luteotropic hormone，LH)5.52 MIU/ml，基礎竇卵泡14個，采用注射用醋酸曲普瑞林(達菲林，益普生制藥有限公司)1.2 mg長方案降調節22 d后給予人促性腺激素(Gn)150 IU/d，連用12 d。當卵泡直徑大于18 mm的卵泡數為8個，占發育卵泡60%時，注射重組人絨促性素(艾澤，默克雪蘭諾公司)250 μg 36 h后，陰道B超引導下穿刺取卵，穿刺18個卵泡獲得17個卵子。由于取卵日患者丈夫因車禍在治療中不能來院取精，患者要求冷凍卵母細胞并簽署知情同意書。故在取卵后2 h給予透明質酸酶80 IU消化20～30 s后脫顆粒細胞，在倒置顯微鏡下觀察有13個成熟卵(MⅡ期)，4個未成熟卵(GV期)。對13個MⅡ期卵行玻璃化冷凍，1～2個/管共7管，冷凍試劑盒采用Irvine公司通用玻璃化冷凍試劑盒。2015年7月，夫婦倆來院申請解凍卵母細胞后行體外受精胚胎移植術治療。女方采用促排卵周期準備內膜，注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)5 000 IU 36 h后解凍卵母細胞，解凍13個卵母細胞，存活12個，同時囑男方取精，處理后行卵胞漿內單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)后正常受精9個，卵裂8個，可利用胚胎6個，其中優胚4個。于受精后72 h(D3)移植2枚胚胎，冷凍4枚。移植日內膜厚度12 mm，移植后肌注黃體酮60 mg/d，14 d后檢測血HCG陰性，未妊娠。2015年8月患者再次來院申請解凍移植，采用自然周期準備內膜，移植日內膜厚度11 mm，解凍移植2枚優胚后常規肌注黃體酮60 mg/d，14 d后血HCG陽性，35 d后 B超顯示宮內單胎妊娠，至2015年11月繼續妊娠中。

2 討 論

1986年Chen等[1]應用程序冷凍技術成功冷凍、復蘇了人卵母細胞并獲嬰兒出生，但采用傳統冷凍保護劑PROH和蔗糖的程序冷凍技術的復蘇存活率和受精率低。1999年Kuleshova等[2]應用玻璃化冷凍法成功冷凍、復蘇卵母細胞并獲分娩以后，玻璃化冷凍卵母細胞的效率大大提高。卵母細胞體積大(80～130 μm)，在冷凍過程中滲透性冷凍保護劑進入細胞膜和水分滲透出細胞膜的速度均明顯較慢，容易形成細胞內冰晶，另外卵母細胞的一些特殊結構微管、微絲、紡錘體也易受冷凍的影響，冷凍損傷卵母細胞的骨架，尤其是紡錘體結構進而影響卵母細胞的生理功能，影響復蘇存活率和胚胎發育[3]。目前傳統的程序冷凍技術逐漸被玻璃化冷凍技術替代。玻璃化冷凍采用高濃度的低溫保護劑，高滲透性抗凍劑在短時間內達到細胞內、外的濃度平衡，將細胞內大部分水置換，并與剩余水分形成氫鍵，降低凍結部分電解質濃度，使細胞減輕鹽害及溶液效應；同時也改變了胞內過冷狀態，使細胞內壓接近細胞外壓，降低了細胞脫水皺縮程度和速度，減小了細胞的損傷，成為目前卵子冷凍方法的主流。

國際上卵母細胞冷凍技術主要用于女性生育力的保存，如有生育要求的未婚女婦女或腫瘤患者在放療和化療前進行卵母細胞的冷凍保存。在我國該技術未被廣泛應用，目前主要用于供卵周期或取卵日男方取不出精子時[4-6]。當然睪丸取精是預測和干預取卵日取精失敗的保障，可以避免卵母細胞的冷凍[7]。筆者對于本例患者獲得成功的體會有以下幾點：(1)使用適合的玻璃化試劑盒，并嚴格按操作說明操作，卵子冷凍可以得到較好的復蘇效果。(2)采用Cryotop冷凍載桿，冷凍時減少保護液量，同時每支載桿最多裝載2個卵子，使細胞迅速度過冷凍解凍的溫度危險區。(3)卵子的冷凍時機很重要，盡可能在取卵后3 h內冷凍，否則卵子老化影響ICSI授精后的卵裂速度。 雖然有報道認為冷凍GV期比MⅡ期的解凍存活率更高[8]，但GV期復蘇行體外成熟再ICSI受精后的發育潛力較低，故本例未冷凍GV期卵母細胞，但隨著研究技術的發展，冷凍GV期卵母細胞將會得到更好的應用。

卵母細胞冷凍保存作為生育力保存的重要組成部分，在特殊情況下發揮著不可替代的作用。作為取卵日男方取精失敗的措施，卵子玻璃化冷凍是減少患者相關損失的最后保障。目前對卵母細胞安全性仍有待研究[9-10]。隨著玻璃化冷凍技術的不斷發展和國家法律法規的不斷完善，該技術將可廣泛應用于臨床。

[1] Chen C.Pregenancy after human oocyte cryopreservation[J].Lancet,1986,1(8 486):884-886.

[2] Kuleshova L,Gianaroli L,Magli C,et al.Birth following vitrification of a small number of human oocytes:case report[J].Hum Reprod,1999,14(12):3 077-3 079.

[3] 李 媛.人類輔助生殖實驗技術[M].北京:科學出版社,2008:170-172.

[4] 王 媁,嚴正杰,蔡令波,等.卵子冷凍技術的臨床應用[J].中華醫學雜志,2008,88(39):2 755-2 758.

[5] 劉衛衛,孫瑩璞,宋文妍,等.卵母細胞玻璃化凍融21例臨床分析[J].現代婦產科進展,2010,19(3):165-167.

[6] 吳 歡,張靜靜,賀小進,等.取卵日男方取精困難的應對策略及助孕結局分析[J].生殖與避孕,2014,34(10):813-818.

[7] 高興成,胡 鵬.取卵日因手淫取精失敗改行手術取精及時干預對于卵胞漿內單精子注射結局的影響[J].中華臨床醫師雜志:電子版,2012,6(13):31-34.

[8] Boiso I,Martí M,Santaló J,et al.A confocal microscopy analysis of the spindle and chromosome configurations of human oocytes cryopreserved at the germinal vesicle and metaphase Ⅱ stage[J].Hum Reprod,2002,17(7):1 885-1 891.

[9] 邢 瓊,章志國,周 平,等.人類未成熟卵母細胞玻璃化冷凍研究[J].生殖與避孕,2008,28(10):593-597.

[10]Shaw-Jackson C,Van Beirs N,Thomas AL,et al.Can healthy babies originate from oocytes with smooth endoplasmic reticulum aggregates? A systematic mini-review[J].Hum Reprod,2014,29(7):1 380-1 386.

唐永梅(1975～)，女，本科，副主任技師，研究方向：輔助生殖實驗室技術。

R 714.13

B

0253-4304(2016)04-0579-02

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.04.41

2015-11-30

2016-02-23)