水下沖擊波致兔脊髓損傷的神經機能變化及其病理特點

姜永田 滕海軍 張 棟 謝 東

(1 濰坊醫學院研究生系研究生教研室，濰坊市 261000，E-mail：yongtian818@163.com；2 中國人民解放軍第89醫院脊柱外科，濰坊市 261021；3 山東省淄博市臨淄區人民醫院脊柱外科，淄博市 255400)

論著·基礎研究

水下沖擊波致兔脊髓損傷的神經機能變化及其病理特點

姜永田1滕海軍2張 棟3謝 東1

(1 濰坊醫學院研究生系研究生教研室，濰坊市 261000，E-mail：yongtian818@163.com；2 中國人民解放軍第89醫院脊柱外科，濰坊市 261021；3 山東省淄博市臨淄區人民醫院脊柱外科，淄博市 255400)

目的 探討水下沖擊波致兔脊髓損傷的神經機能變化及其病理特點。方法 選取48只新西蘭大白兔隨機分為A、B、C、D組各12只，通過手術將大白兔脊髓暴露后將其固定于封水倉內，僅椎板切除段脊髓外露于沖擊波作用之下，用銨松蠟炸藥2 g為水下爆源，其中A、B、C組分別按沖擊波到達脊髓表面的超壓峰值2.6 MPa、2.8 MPa、3.0 MPa致傷，檢測沖擊波的超壓峰值及作用時間。D組不致傷，作為對照組。通過BBB法運動學評分、體感誘發電位檢測、脊髓組織蘇木精-伊紅(HE)染色及透射電鏡觀察，評估各組水下沖擊波致脊髓損傷后的神經機能變化及病理特點。結果 水下沖擊波致傷后，實驗組動物均癱瘓，D組沒有癱瘓。致傷12 h及24 h后A組、B組、C組的BBB評分依次減低(P<0.05)，且均低于D組(P<0.05)；致傷24 h后A、B、C各組大白兔BBB評分低于致傷12 h后(P<0.05)。致傷12 h及24 h后A組、B組、C組的體感誘發電位潛伏期依次延長(P<0.05)，且均高于D組(P<0.05)；波幅依次下降(P<0.05)，且均低于D組(P<0.05)。與致傷12 h后比較，A組、B組、C組致傷24 h后的潛伏期均延長(P<0.05)，A組及B組波幅均下降(P<0.05)。致傷48 h時組織形態學和電鏡下示A組、B組、C組脊髓出血壞死，結構破壞，髓鞘板層分層，軸索變形水腫，A組、B組、C組動物脊髓HE染色陽性率依次降低(P<0.05)，且均低于D組(P<0.05)。結論 水下沖擊波可造成水下動物脊髓損傷，其致傷程度與動物接受的爆炸沖量有關，且在一定時間內存在繼發性損傷。

脊髓損傷；水下沖擊波；神經機能；病理；兔

水下沖擊傷是現代戰爭中的一種常見傷，尤其在島嶼作戰和登陸作戰中常見，以往戰爭中水下沖擊傷發生率較高[1]，其死亡率高[2]。20世紀60～70年代國外曾對水下沖擊傷的防護進行了大量研究；國內對水下沖擊傷也做了一系列研究，在沖擊損傷機制、生物力學響應、人體耐受性及防護研究等取得了一定成果[3]。隨著對水下沖擊傷研究的深入，國內外學者發現水下沖擊波不僅對空腔臟器可造成損傷，對實質臟器(如中樞神經系統)也可造成傷害[4]。本實驗旨在探索水下沖擊波對脊髓造成損傷的特點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 由魯抗實驗動物繁育中心提供的成年新西蘭大白兔48只(許可證號：41880120)，雌雄不限，體重2.1～2.6 kg，3～4個月齡。飼料配方為10%豬油、37%蔗糖混合53%基礎飼料，由江蘇雙獅實驗動物飼料有限公司配制，上、下午各喂養1次。采用隨機區組法將大白兔分為分為 A、B、C、D組各12只，將大白兔固定于封水倉內，僅椎板切除段脊髓外露于沖擊波作用之下，A、B、C組(實驗組)分別按照沖擊波到達脊髓表面的不同超壓峰值(2.6 MPa、2.8 MPa、3.0 MPa)致傷，D組不致傷，作為對照組。術前所有大白兔均采用Basso Beattie Bresnahan(BBB)法[5]行運動學評分，均完全正常。術前各組均行體感誘發電位檢測，4組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 術前各組動物體感誘發電位潛伏期和波幅(x±s)

1.2 主要試劑及儀器 3%戊巴比妥鈉注射液(美國Sigma公司，批號：F20140205)，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒(上海化學總公司試劑分部，批號：150723)，生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司，型號CX21)，肌電圖誘發電位儀 (丹麥丹迪公司，型號NDI-092)，水下壓力自動測試儀 (杭州美控自動技術有限公司，型號R2008S)，銨松蠟炸藥2 g(龍海爆破研究所，批號140603)，實驗水槽(中國人民解放軍第89醫院中心實驗室，型號QT0357D)。

1.3 方法

1.3.1 水下沖擊波參數測定：水下爆炸源采用銨松蠟炸藥2 g，水下0.3 m實驗水槽中心位置安置爆炸源。固定爆炸源，調整傳感器與其的距離，記錄產生超壓峰值為2.6 Mpa、2.8 Mpa、3.0 Mpa時的爆炸源與傳感器的距離，實驗時將相應分組的大白兔放置在此，并應用杭州美控自動技術有限公司研發的R2008S沖擊波測試分析系統分別檢測距離爆炸源不同距離的沖擊波超壓峰值和持續時間。

1.3.2 脊髓沖擊傷模型的建立：用濃度為3%戊巴比妥鈉注射液(25 mg/kg)經耳緣靜脈對大白兔進行麻醉，備皮，將四肢及頭部俯臥位固定于特制的固定架上。以T9為中心取背部正中皮膚切口，長約6 cm，暴露 T8～T10。咬除椎板，充分顯露硬脊膜。調制水溫為30℃左右，將A、B、C 3組實驗動物分別放置于水下1 m的實驗水槽中，制作通氣道保證呼吸正常進行，選用質地結實的橡膠覆蓋實驗動物背部，對重要臟器給予保護，橡膠板開一直徑為5 cm圓孔，顯露脊柱脊髓實驗區域，將特制銨松蠟炸藥2 g分別安置于距爆炸源不同距離處，調節脊髓節段垂直于爆炸沖擊波傳導的方向，調整好位置使之正好對準暴露的硬脊膜，檢驗動物模型是否穩定、牢固；電子發爆器水下引爆。按 A、B、C組分別以2.6 Mpa、2.8 Mpa、3.0 Mpa超壓峰值壓力，給T8～T10節段實施單次沖擊。D組動物暴露脊髓后放于水中，不作水下沖擊波沖擊。動物納入實驗組的標準為：(1)動物存活；(2)大白兔雙后肢不同程度的抽搐、尾巴搖擺；(3)家兔背部僅傷及皮膚，皮下組織無穿透傷。大白兔致傷后，每日肌注青霉素3萬U/次，每2次/d、按摩膀胱協助排尿，各組分籠飼養，喂養同術前，各組無區別。

1.3.3 運動學評分：分別于沖擊波沖擊前、沖擊后12 h和24 h，采用雙盲法根據BBB評分法分別對各組大白兔進行評分，每只兔子至少觀察5 min。本實驗中BBB評分≥16分記為正常，BBB評分<16分記為癱瘓[6]。

1.3.4 體感誘發電位：分別于沖擊波沖擊前、沖擊后12 h和24 h，將所有大白兔麻醉后固定于固定架上，將針式電極作為記錄電極，置于兩耳連線與矢狀縫交點，大白兔鼻根部接參考電極，前肢貼地。在單側后肢跟腱內上方放置叉狀刺激電極，采用波寬為0.2 ms的脈沖電流以3 Hz的頻率刺激兔單側脛后神經，以刺激兔趾輕微抽搐為準，電流3～4 mA，分析時間為 15 ms，平均行80～100次檢測。

1.3.5 組織形態學檢查：于沖擊波沖擊后48 h將所有大白兔麻醉，然后用4%多聚甲醛-磷酸緩沖固定液經左心室行心臟灌注固定，解剖椎管，取2 cm T9～T10節段脊髓，放入4﹪多聚甲醛液中2周后，脫水，石蠟包埋，每隔6張取1張，行橫斷面切片，常規HE染色。各組12只大白兔全部納入計數，每只計數5張，400倍光鏡下，每張切片隨機選取損傷部位中心左側和右側視野各一，由不了解實驗進程及分組情況的人員觀察脊髓組織神經元的形態變化，并手工計數，取每張切片兩側視野正常神經元的數量之和的平均值，即為每個標本存活神經元數量的平均值。

1.3.6 透射電鏡下觀察：于沖擊波沖擊后48 h將2 cm T9～T10節段脊髓先在2.5%戊二醛中固定6 h，用pH 7.4的磷酸緩沖液充分清洗后，再用1%鋨酸固定，脫水、包埋，行超薄切片，每張厚50～60 mm，透射電鏡下觀察各組脊髓神經元的超微結構變化，透射電鏡下觀察結構有無破壞，髓鞘板層有無分層，軸索有無變形水腫，并拍照。

1.4 統計學分析 采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計量資料以(x±s)表示，兩組均數比較方差齊時采用t檢驗，方差不齊則采用t′檢驗，多組均數比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組水下沖擊波物理參數 隨著距離爆心距離越遠，水下沖擊波超壓峰值越大(P<0.05)，但各組持續時間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3個實驗組水下沖擊波物理參數(x±s)

注：與C組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

2.2 肢體運動學評分 水下沖擊波致傷后12 h及24 h，實驗組動物均為癱瘓，對照組D組沒有癱瘓。沖擊后12 h及24 h A組、B組、C組的BBB評分依次減低(P<0.05)，均低于D組。沖擊后24 h實驗組(A、B、C)各組大白兔的BBB評分較12 h降低(P<0.05)。見表3。

表3 致傷后12 h和24 h各組動物BBB評分(x±s，分)

注：與A組比較，#P<0.05； 與B組比較，*P<0.05；與C組比較，▲P<0.05。

2.3 致傷后12 h和24 h各組動物體感誘發電位潛伏期和波幅 體感誘發電位沖擊后12 h及24 h A組、B組、C組的體感誘發電位潛伏期依次延長(P<0.05)，且均高于D組(P<0.05)，波幅依次下降(P<0.05)，且均小于D組(P<0.05)。與沖擊后12 h比較，A組、B組、C組沖擊后24 h的潛伏期均延長(P<0.05)，A組及B組波幅均減小(P<0.05)。見表4。

表4 致傷后12 h和24 h各組動物體感誘發電位潛伏期和波幅(x±s)

注：與A組比較，#P<0.05； 與B組比較，*P<0.05；與C組比較，▲P<0.05。

2.4 4組脊髓組織形態學改變及存活神經元數量 致傷后48 h，A組脊髓出現少量散在出血壞死灶，正常神經細胞比例減少不明顯；B組可見較多散在出血壞死灶，以灰質為主；C組可見灰質大量神經細胞凋亡，白質神經細胞脫髓鞘化嚴重，正常神經細胞比例減少至(28.21±2.52)%；D組脊髓組織無明顯改變，正常神經細胞比例為(96.23±1.09)%。A、B、C組動物脊髓HE染色陽性率依次降低(P<0.05)，且均低于D組(P<0.05)。見表5。

表5 致傷后48 h各組動物脊髓HE染色陽性率(x±s，%)

注：與A組比較，#P<0.05； 與B組比較，*P<0.05；與C組比較，▲P<0.05。

2.5 電鏡下觀察情況 A組髓鞘板層略有分層，近端軸管內密度不均，微管減少，軸索變形、變性，水腫。B組髓鞘板層分層，軸索變形，軸索內微管明顯減少，部分髓鞘與軸索剝離、腫脹。C組髓鞘板層分層，水腫、出血，呈“洋蔥樣”改變，部分髓鞘與軸索剝離；水下沖擊傷后髓鞘局灶性疏松，近側軸索內線粒體腫脹、變性。D組正常。

3 討 論

沖擊傷是指沖擊波共同作用于機體所產生的各種損傷，主要由超壓和負壓引起。沖擊波在水下由于水底硬度和密度的不同，反射和吸收的量也會有所差異。空氣密度約為水的1/800，且壓縮性和稀散性遠高于水，故水下沖擊波相對空氣沖擊波具有傳播速度快、傳播距離遠的特點，其致傷效應也與空氣沖擊波有所不同[7-8]。水下沖擊波的傳播速度是相同強度空氣沖擊波的3.2～4.1倍，相同質量三硝基甲苯水下爆炸是等距離地面爆炸壓力值的227.1～247.2倍，沖量的8.2～11.2倍。當沖擊波在水中傳播至剛性障礙物，如礁石或水底時會發生反射，放大沖擊波效應；當水下沖擊波傳至水與空氣的交界面時，會反射而形成水中的拉伸波。水下沖擊波物理參數的特征表現為峰值壓力高，前沿上升時間僅數微妙，沖量大，但持續時間僅為數百微秒級。沖擊傷的發生機制包括碎裂效應、內爆效應、慣性效應、壓力差效應、血流動力學效應、負壓與肺泡擴張效應、生物力學效應等[9]。水下沖擊波對生物的殺傷效應顯著強于空氣沖擊波，肺和腹腔臟器的損傷是早期救治的重要環節，損傷發生率高、死亡率高。

既往很多學者對水下沖擊波對空腔臟器的損傷進行了大量研究，并且基本掌握了水下沖擊波致空腔臟器損傷的規律[10-14]。在實踐中，絕大多數水下沖擊波會造成肺等空腔臟器損傷，致動物死亡。近年來發現水下沖擊波對神經組織也會造成損傷[4]。本實驗在保護動物其他臟器的前提下，觀察了水下沖擊波致脊髓損傷后的神經機能變化以及病理學特點。本研究結果顯示，沖擊后12 h及24 h A組、B組、C組的BBB評分依次減低(P<0.05)，提示隨著水下沖擊波超壓峰值增高，大白兔癱瘓程度也加重。且在沖擊后12 h及24 h，隨著水下沖擊波超壓峰值增高，大白兔體感誘發電位的潛伏期逐漸延長、波幅逐漸減小(P<0.05)，表明脊髓損傷程度的逐漸加重。沖擊后24 h A組、B組、C組的BBB評分和體感誘發電位的改變較12 h加重，提示水下脊髓沖擊傷后存在繼發性損傷，導致脊髓損傷逐漸加重。傷后48 h組織光鏡結果顯示，隨著水下沖擊波超壓峰值增高，大白兔脊髓灰質神經細胞壞死、白質脫髓鞘化增多，壞死區逐漸增多，存活的正常神經細胞明顯減少，神經細胞脫髓鞘加重。表明水下沖擊波致脊髓損傷時，脊髓損傷程度與沖擊波的當量呈正相關。這提示水下脊髓沖擊傷患者應及早救治，防止受傷后由于繼發性損傷導致脊髓神經元發生不可逆損傷，對脊髓的防護也尤為重要。

目前，由于實驗條件和技術的不同，得到的數據差異性較大，以及動物與人體的實際差異性，動物實驗中取得的定量數據不可推論到人體。在脊髓水下沖擊傷中，脊髓凋亡細胞類別及其凋亡機制仍需進一步研究。脊髓水下沖擊傷往往不是作為單一的損傷存在，水下沖擊波造成的肺、胃、肝等空腔臟器的損傷對機體內環境的改變，是否參與脊髓的繼發性損傷也需要進一步研究。

[1] Bellamy RF,Zajtchuk R,Buescher TM.Conventional warfare:ballistic,blast,and burn injuries[M].Washington DC:Office of Surgeon General of the United States,1991:231-232,258-260.

[2] 楊志煥,朱佩芳,蔣建新,等.水下沖擊傷損傷特點的初步探討[J].中華創傷雜志,2003,19(2):111-114.

[3] 黃健松.水下沖擊傷的特點及研究進展[J].海軍醫學雜志,2004,25(2):168-170.

[4] Wang Y,Ye Z,Hu X,et al.Morphological changes of the neural cells after blast injury of spinal cord and neuroprotective effects of sodium beta-aescinate in rabbits[J].Injury,2010,41(7):707-716.

[5] Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open filed testing in rats[J].J Neurotrauma,1995,12(1):1-21.

[6] Fournier AE,Takizawa BT,Strittmatter SM.Rho kinase inhibition enhances axonal regeneration in the injured CNS[J].J Neurosci,2003,23(4):1 416-1 423.

[7] 寧 心,李曉炎,楊志煥,等.水下沖擊波和空氣沖擊波傳播速度及物理參數的對比研究[J].解放軍醫學雜志,2004,29(2):97-99.

[8] 楊志煥,朱佩芳,蔣建新,等.水下沖擊波的生物效應[J].爆炸與沖擊,2003,23(2):134-139.

[9] 王正國.原發沖擊傷的發生機制[J].解放軍醫學雜志,1995,20(4):315-317.

[10]朱國標,王正國,周 萍,等.大鼠沖擊傷時肺超微結構變化[J].第三軍醫大學學報,1989,11(1):14-17.

[11]趙 敏,王正國,劉大維,等.沖擊傷大鼠肺形態變化的定量研究[J].第三軍醫大學學報,1989,11(5):340-344.

[12]夏云寶,藺世龍,耿承軍,等.家兔水中沖擊傷的胸部X線表現及與病理對照[J].中國醫學影像技術,2010,26(9):1 652-1 654.

[13]劉大維,楊志煥,周繼紅,等.水下沖擊傷后犬主要臟器的病理學改變[J].西北國防醫學雜志,2009,30(1):1-4.

[14]藺世龍,劉景昌,王建軍,等.水中沖擊傷動物傷情特點與臟器組織病理學的變化[J].中國微循環,2003,7(6):348-351.

Neuro-electrophysiological changes and pathological features of spinal cord injury caused by underwater shock waves in rabbits

JIANGYong-tian1,TENGHai-jun2,ZHANGDong3,XIEDong1

(1DepartmentofPostgraduate,SchoolofPostgraduate,WeifangMedicalCollege,Weifang261000,China; 2DepartmentofSpinalSurgery,the89thHospitaloftheChinesePeople′sLiberationArmy,Weifang261021,China; 3DepartmentofSpinalSurgery,LinziDistrictPeople′sHospitalofZiboCity,ShandongProvince,Zibo255400,China)

Objective To explore the neuro-electrophysiological changes and pathological features of spinal cord injury caused by underwater shock waves in rabbits.Methods Forty-eight New Zealand rabbits were randomly divided into Group A,Group B,Group C and Group D,with 12 rabbits in each group.After surgical exposure of spinal cord,the rabbits were fixed in the sealing water storehouse,and only the spinal cords with laminectomy were exposed to shock waves.Ammonium nitraterosin paraffin explosive with the dose of 2 g was taken as underwater blasting source.The rabbits of Group A,Group B and Group C were vulnerated by the overpressure peaks of 2.6 MPa,2.8 MPa,3.0 MPa from shock waves to spinal cord surfaces,respectively.The overpressure peak and actuation duration were measured.Group D was not vulnerated and was taken as control.The neuro-electrophysiological changes and pathological features of spinal cord injury in each group were evaluated using BBB Kinematics score,somatosensory evoked potential,hematoxylin-eosin(HE) staining of spinal cord tissues and transmission electron microscopy after spinal cord injury caused by underwater shock waves.Results After 12 hours of injury caused by underwater shock waves,paralysis was observed in all rabbits in the experimental groups,but not in Group D.After 12 and 24 hours of injury,the BBB scores decreased in the order of Group A,Group B and Group C(P<0.05),and the scores of these three groups were lower than the score of Group D(P<0.05).The BBB score after 24 hours of injury was lower than that after 12 hours of injury in Group A,Group B or Group C(P<0.05).After 12 and 24 hours of injury,the latent period of somatosensory evoked potential prolonged in the order of Group A,Group B and Group C(P<0.05),and the potential of these three groups were higher than that of Group D(P<0.05).And the amplitude of somatosensory evoked potential decreased in the order of Group A,Group B and Group C(P<0.05),and the amplitude of these three groups were lower than that of Group D(P<0.05).The latent period was longer in Group A,Group B or Group C,and the amplitude decreased after 24 hours of injury in Group A or Group B compare to those after 12 hours of injury(P<0.05).After 48 hours of injury,the results of histomorphology and electron microscopy showed that hemorrhage and necrosis structure damage,myelin layered plate layer,axonal deformation edema were observed in the spinal cords of Group A,Group B and Group C.The positive rate of HE staining of spinal cord tissues decreased in the order of Group A,Group B and Group C(P<0.05),and the rates of these three groups were lower than that of Group D(P<0.05).Conclusion Underwater shock wave can cause underwater spinal cord injury in animals,and the severity of injury is associated with the explosion impulse accepted,and the secondary injury exists during a certain period.

Spinal cord injury,Underwater shock waves,Nervous function,Pathology,Rabbit

姜永田(1989～)，男，在讀碩士研究生，研究方向：脊柱外科。

滕海軍(1970～)，男，博士，副主任醫師，研究方向：脊柱外科，E-mail：tenghaijun89@163.com。

R 651.21

A

0253-4304(2016)04-0457-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.04.03

2015-11-30

2016-02-18)