山竹果皮提取物對人肝癌細胞HepG2增殖及凋亡的影響▲

賴燕燕 黃應雯 黃丹玚 伍蘭嵐 羅彬尤 李曉龍

(1 廣西衛生職業技術學院細胞生物學與遺傳學教研室，南寧市 530021，E-mail：yanyanlai630@outlook.com；2 廣西中醫藥大學第一附院醫院辦公室，南寧市 530021；3 廣西醫科大學，南寧市 530021)

論著·基礎研究

山竹果皮提取物對人肝癌細胞HepG2增殖及凋亡的影響▲

賴燕燕1黃應雯2黃丹玚3伍蘭嵐3羅彬尤3李曉龍3

(1 廣西衛生職業技術學院細胞生物學與遺傳學教研室，南寧市 530021，E-mail：yanyanlai630@outlook.com；2 廣西中醫藥大學第一附院醫院辦公室，南寧市 530021；3 廣西醫科大學，南寧市 530021)

目的 探討山竹提取物對人肝癌細胞HepG2增殖及凋亡的影響及其作用機制。方法 采用MTT法檢測不同濃度山竹提取物對HepG2細胞增殖的影響；分別應用Annexin-V/PI雙重染色、PI單染法檢測山竹提取物對HepG2凋亡和細胞周期的影響；天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)試劑盒檢測山竹提取物對HepG2細胞Caspase-3酶活化的影響。結果 不同濃度(100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L、800 μmol/L)山竹提取物均可抑制人肝癌細胞HepG2的增殖活性，且隨著山竹提取物濃度及其作用時間的增加，細胞抑制率升高(P<0.05)；山竹提取物濃度為256.67 μmol/L時可誘導人肝癌細胞HepG2出現早期凋亡，并且隨著山竹提取物作用時間的增加，凋亡早期癌細胞的比率增高。細胞周期分析結果顯示隨著山竹提取物的濃度升高(0 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L、800 μmol/L)，G1期HepG2細胞比例升高，而S期細胞比例下降(P<0.05)。與對照組(0 μmol/L)比較，各濃度(200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L、800 μmol/L)山竹提取物組HepG2細胞的Caspase-3酶活性均升高(P<0.05)，給藥組的酶活力單位隨給藥濃度的增加而明顯增加(P<0.05)。結論 山竹提取物對人肝癌細胞HepG2有抑制增殖和促進凋亡的作用，其作用機制可能與抑制HepG2細胞進入S期和激活Caspase-3有關。

肝癌；人肝癌細胞HepG2；山竹提取物；增殖；凋亡；細胞周期；天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3

肝癌在我國常見腫瘤中位居第2位，僅次于肺癌[1]，而我國是全球肝癌發病率最高的國家，其發病率比西方國家高10倍以上。據統計，目前我國肝癌發病人數占全球發病人數的55%，而死亡的人數約占全世界肝癌死亡人數的45%[2]。手術切除是目前治療早期肝癌唯一有效的方法，但大多數患者就診時已為中晚期，手術療效有限，因而尋找新的治療方法尤為重要。在天然藥物中尋找具有調控細胞增殖、凋亡的化合物單體或前體化合物，是目前國內外抗腫瘤藥物研發的熱點。

山竹又稱山竹子、莽吉柿或鳳果，是藤黃科藤黃屬常綠喬木山竹的果實。山竹果皮性涼，味苦、澀，是泰國、緬甸、印度等東南亞國家的傳統醫藥，山竹果皮研為細末內服，被廣泛用于治療腹痛、腹瀉、痢疾、感染性創傷、化膿、慢性潰瘍等疾病[3-4]；外敷可起到消炎止痛的作用，用于治療皮膚病，水、火燙傷尤為顯效[5]。山竹果殼含有多種氧雜蒽酮衍生物，主要包括山竹提取物(75%～85%)和γ-倒捻子素(5%～15%)，其藥理作用成為了近年來的研究熱點。近期有研究表明這些氧雜蒽酮表現出抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性，對多種細菌具有抗菌作用[6]。有學者通過研究發現山竹果皮提取物具有抗菌活性、細胞和生物毒性、酶抑制活性、抗病毒活性、殺傷癌細胞等作用[5，7-12]。但山竹提取物對肝癌HepG2細胞的作用及抗腫瘤機制目前尚未見報道。本研究通過探討山竹提取物其對肝癌HepG2 細胞的作用及其可能的抗腫瘤機制，為進一步研究山竹提取物的藥用價值以及其抗腫瘤作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 山竹果皮粉由廣西中醫藥大學第一附屬醫院提供，人肝癌細胞HepG2由廣西醫科大學實驗中提供；HyClone DMEM/高糖培養基[賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司，批號：NXM0766]，胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)消化液(北京索萊寶科技有限公司，批號：T1300-100)，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS；武漢博士德生物工程有限公司，批號：AR0030)，四甲基偶氮唑鹽(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所，批號：C0009)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；Amresco公司，批號：302A031)，四季青無支原體胎牛血清(L浙江天杭生物科技有限公司，批號：130407)，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(L聯科生物科技有限公司，批號：2100512)，細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所，批號：C1052)，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，Caspase-3)活性檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所，批號：C1115)；酶標儀(Tecan.公司，型號：Sunrise)，流式細胞儀(BD公司，型號：InfluxTM)，顯微鏡(Olympus公司，型號：IX-51)，臺式離心機(Eppendorf公司，型號：5424)。

1.2 實驗方法

1.2.1 山竹提取物的制備：取50 g的山竹果皮干燥粉末，溶于500 ml的85%乙醇，過夜(16 h)，過濾取上清液；旋蒸至10 ml，用乙酸乙酯萃取，取上清液；過硅膠柱，用正己烷和乙酸乙酯(5 ∶1)洗脫；得到的液體烘干，用DMSO溶解，置于-20℃冰箱冷凍保存備用[13]。

1.2.2 細胞培養：對肝癌HepG2細胞進行體外培養，基礎培養基為HyClone DMEM/高糖培養液，加入無支原體胎牛血清配置成含10%無支原體胎牛血清的培養液，在37℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.3 MTT法檢測山竹提取物對HepG2細胞的生長抑制作用：取對數生長期的HepG2細胞，調整細胞懸液濃度至1×105個/ml，接種于96孔板中，每孔100 μl，在37℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養24 h，細胞貼壁后[14]，藥物處理組加入用培養液稀釋的山竹提取物，使終濃度分別為100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L、800 μmol/L，每孔總量100 μl。同時設置陰性對照組(含有細胞的培養基、MTT溶液，不含藥物)和空白對照組(含PBS及MTT溶液，不含藥物)。各個藥物處理組及陰性對照組每組設6個復孔。繼續培養24 h、48 h、72 h后，每孔加入1 mg/ml MTT溶液20 μl，37℃孵育4 h后棄培養基，每孔加入150 μl DMSO振蕩10 min，使結晶物充分溶解。用酶聯免疫檢測儀于490 nm波長處測定吸光度值(A值)。按下列公式計算抑制率：腫瘤細胞抑制率(%)=(藥物處理組A 490 nm-空白組A 490 nm)/(陰性對照組A 490 nm-空白組A 490 nm)×100%。

1.2.4 Annexin V-PI 法檢測山竹提取物對HepG2細胞凋亡的影響：取對數生長期的HepG2細胞，調整細胞懸液濃度1×106個/ml，每孔加入2 ml，均勻鋪在6孔板中，在37℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養48 h后，加入用培養液將山竹提取物稀釋至256.67 μmol/L(即IC50濃度)，每孔2 ml，分別培養0 h、24 h、48 h及72 h；將6 孔板中的各處理組HepG2細胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，1 000 r/min離心5 min后 收集細胞； 用PBS 洗滌細胞2次(1 000 r/min，10 min)，收集細胞；加入500 μl的結合緩沖液，吹打懸浮細胞； 加入5 μl Annexin V-FITC 混勻后，加入10 μl碘化丙啶(propidium iodide，PI)，混勻；在室溫、避光的條件下孵育5 min；在1 h內采用流式細胞儀進行檢測細胞凋亡情況[15]。

1.2.5 PI單染法檢測山竹提取物對細胞周期的影響：收集對數期HepG2細胞，調整細胞懸液濃度1×106個/ml，每孔加入2 ml，均勻鋪在6孔板；5% CO2、37℃細胞培養箱內孵育，至細胞單層鋪滿孔底，小心吸去培養液，加入用培養液稀釋的不同濃度梯度的山竹提取物(0 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L、800 μmol/L)，每孔2 ml，復孔6個，培養24 h；消化收集細胞(同Annexin V-PI法)，用PBS洗1次(1 000 r/min，4 min)，用100 μl PBS重懸，滴入預冷的75%乙醇400 μl，固定過夜(16 h)。離心棄液，用PBS洗1次(1 000 r/min，4 min)，用400 μl PBS重懸細胞，加入PI染色液10 μl[碘化丙啶染色液配法：染色緩沖液3 ml+碘化丙啶染色液(20x)150 μl+RNase A(L50x)60 μl]，室溫黑暗孵育10 min，1 h內上機檢測細胞周期。

1.2.6 Caspase-3的活性檢測：收集對數期HepG2細胞，調整細胞懸液濃度1×106個/ml，每孔加入3 ml，均勻鋪在6孔板；5% CO2、37℃細胞培養箱內孵育，至細胞單層鋪滿孔底，小心吸去培養液，加入用培養液稀釋的不同濃度梯度的山竹提取物(200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L、800 μmol/L)，每孔2 ml，復孔6個，培養24 h；消化收集細胞，用PBS洗1次(1 000 r/min，4 min)，按每200萬細胞加入100 μl裂解液，重懸細胞，冰浴裂解15 min，16 000～20 000 g/min離心15 min，轉移上清液至冰浴預冷的試管；空白對照組(90 μl檢測緩沖液+10 μl Ac-DEVD-pNA)，樣品組(80 μl檢測緩沖液+10 μl Ac-DEVD-pNA+10 μl待測樣品)，37℃孵育2 h，顏色變化明顯后上酶標儀機檢測樣品中Caspase 3催化產生的pNA產生的吸光度。

1.3 統計學分析 采用SPSS 17.0進行統計分析，計量資料以(x±s)表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 山竹提取物對HepG2細胞的增殖抑制作用 不同濃度藥物處理組分別培養24 h、48 h，72 h后，山竹提取物對HepG2細胞的增殖均具有抑制作用，且隨著山竹提取物濃度和作用時間的增加，細胞抑制率升高(P<0.05)；山竹提取物對HepG2細胞的生長有量-效、時-效關系。見表1。24 h、48 h、72 h的IC50值分別為294.90 μmol/L、256.67 μmol/L、178.59 μmol/L。

2.2 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡的結果 在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限是活細胞，為(FITC+/PI+)；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為(FITC-/PI+)；而右下象限為凋亡細胞，顯現(FITC+/I-)在HepG2細胞組中，提示山竹提取物可引起肝癌細胞HepG2的凋亡。見圖1。加入用培養液稀釋至濃度為256.67 μmol/L(IC50濃度)的山竹提取物后，肝癌細胞HepG2出現明顯早期凋亡；在0 h、24 h、48 h、72 h早期細胞凋亡率分別為0.05%、11.63%、55.98%、73.38%，隨著山竹提取物作用時間的增加凋亡早期癌細胞的比率顯著增高。

表1 不同濃度山竹提取物作用下HepG2細胞生長抑制率的比較(x±s，%)

注：相同時間點下不同濃度組間兩兩比較，*P<0.05；相同濃度下不同時間點兩組間兩兩比較，●P<0.05。

A 0 h

B 24 h

C 48 h

D 72 h

2.3 山竹提取物對細胞周期的影響 與對照組(山竹提取物濃度為0 μM)比較，各濃度山竹提取物組G1期細胞比例均升高，S期細胞比例均下降 (P<0.05)，且隨著藥物濃度的提高，G1期細胞比例升高，同時S期細胞比例下降(P<0.05)。見表2。

表2 山竹提取物對HepG2細胞周期的影響(x±s，%)

注：G1期細胞組間兩兩比較，*P<0.05；●S期細胞組間兩兩比較，P<0.05。

2.4 Caspase-3的活性 Caspase-3的活性檢測中吸光度越大，產生的pNA越多。Caspase 3酶活力單位的定義：即一個酶活力單位定義為當底物飽和時，在37℃可以剪切1 nmol Ac-DEVD-pNA產生1 nmol pNA的Caspase 3的酶量。故吸光度越大，Caspase 3酶活力越強。隨著藥物濃度的增加，405 nm的吸光度值越大，Caspase 3酶活力增強。與對照組(山竹提取物濃度為0 μM)酶活力單位比較，各濃度山竹提取物組HepG2細胞的Caspase-3酶活性均升高(P<0.05)；給藥組的酶活力單位隨給藥濃度的增加而明顯增加(P<0.05)。見表3。

表3 山竹提取物對HepG2細胞Caspase-3活性的影響(x±s)

注：*與對照組比較，P<0.05，●不同濃度組間兩兩比較，P<0.05。

3 討 論

肝癌是常見病和多發病，可分為原發性和繼發性兩大類。由于肝臟是人體最大的實質性器官，具有重要代謝功能，因此，肝臟一旦出現惡性腫瘤可危及生命。肝臟具有豐富的血流供應，與人體的重要結構如下腔靜脈、門靜脈、膽道系統等關系密切，而肝臟惡性腫瘤發病隱匿，侵襲性生長快速，其治療甚為困難。手術切除是目前治療早期肝癌唯一有效的方法，但大多數患者就診時已為中晚期，手術療效有限，因而尋找新的治療方法尤為重要。在天然藥物中尋找具有調控細胞增殖、凋亡的化合物單體或前體化合物，是目前國內外抗腫瘤藥物研究的熱點。國內外研究表明，山竹具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化活性等作用，但是對其藥理機制的研究卻遠遠落后于對化學成分的研究。因此有必要對山竹及其有效成分的藥理和毒理作用進行進一步的深入研究。

本實驗結果顯示山竹提取物能抑制HepG2細胞增殖并誘導其凋亡，隨藥物作用濃度的增大對細胞增殖抑制的影響逐漸增加(P<0.05)，具有明顯的濃度依賴性，且在一定濃度范圍內具有時間依賴性。山竹提取物濃度為256.67 μmol/L時可誘導人肝癌細胞HepG2出現明顯早期凋亡，并且隨著藥物作用時間的增加凋亡早期癌細胞的比率顯著增高。以上結果說明了山竹提取物能抑制肝癌HepG2細胞的增殖和促使其凋亡。對細胞周期影響的分析結果顯示，與對照組比較，隨著藥物濃度的提高，G1期細胞比例大幅升高，而同時S期細胞比例明顯下降(P<0.05)，提示山竹提取物抑制細胞進入S期從而導致G1期細胞比例大幅升高。

此外，對凋亡的執行者Caspase-3活性蛋白進行檢測的結果顯示，與對照組相比，各濃度山竹提取物組HepG2細胞的Caspase-3酶活性均升高(P<0.05)。提示經山竹提取物處理的HepG2細胞Caspase-3蛋白活性顯著增加。細胞死亡主要有凋亡和壞死兩種表現，兩者之間主要的區別是死亡過程中細胞本身是否主動參與[16]，本研究表明加入藥物處理后，細胞的死亡是通過凋亡途徑進行的。Caspase-3 是真核細胞中最常見的凋亡蛋白，也是研究最為透徹的半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，大多數的細胞凋亡與其有關[17]。這些凋亡通路關鍵酶的激活可能是山竹提取物誘導HepG2細胞凋亡的重要原因。Caspase是一個含有半胱氨酸活性的胞漿蛋白酶家族，迄今至少發現14個成員，其目前發現的Caspase成員中與ced-3同源性最高的，是細胞凋亡過程中激活的關鍵酶，也是細胞凋亡的主要效應分子[18]。Caspase-3在多因素誘導的肝癌細胞凋亡中激活，促進Caspase-3活化和活性，能夠加速肝癌細胞凋亡。然而，目前其活化分子機制尚不清楚，有待于進一步研究，從而為以Caspase-3為靶點的藥物治療提供堅實的理論基礎[19]。

綜上所述，山竹提取物對人肝癌細胞HepG2凋亡有誘導作用，且對肝癌細胞增殖有抑制作用，對肝癌治療有一定價值；其作用機制可能與抑制HepG2細胞進入S期和激活Caspase-3有關，但尚需進一步的研究證實。

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Effects of mangosteen extract on proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells

LAIYan-yan1,HUANGYing-wen2,HUANGDan-yang3,WULan-lan3,LUOBin-you3,LIXiao-long3

(1DepartmentofCytobiologyandGenetics,GuangxiMedicalCollege,Nanning530021,China;2OfficeofHospitalAffairs,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530021,China;3GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore the effects of mangosteen extract on the proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells and its mechanism.Methods Methylthiazolyl tetrazolium(MTT) assay was used to assess the effect of mangosteen extract on the proliferation and apoptosis of HepG2 cells with various concentrations.Annexin-V/PI double staining method and PI single staining method were used to determine the effect of mangosteen extract on the apoptosis and cell cycle of HepG2 cells respectively.Cysteine-containing aspartate-specific proteases-3(Caspase-3) kit was used to assess the effect of mangosteen extract on the Caspase-3 activation of HepG2 cells.Results The mangosteen extract with various concentrations(100 μmol/L,200 μmol/L,400 μmol/L,600 μmol/L and 800 μmol/L) could inhibit the proliferative activity of HepG2 cells,and the inhibitory rate of the cells increased with the increasing concentration of drug and duration of drug action(P<0.05).The mangosteen extract with the concentration of 256.67 μmol/L could induce early apoptosis in HepG2 cells,and the ratio of the cells in early apoptotic stage increased significantly with the increasing duration of drug action.Cell-cycle analysis revealed that the ratio of HepG2 cells in the G1 phase increased and the ratio of the cells in the S phase reduced with the increasing mangosteen extract concentration(0 μmol/L,200 μmol/L,400 μmol/L,600 μmol/L and 800 μmol/L)(P<0.05).Compared to the control group(0 μmol/L),the Caspase-3 activities of HepG2 cells in the groups with different mangosteen extract concentrations(200 μmol/L,400 μmol/L,600 μmol/L and 800 μmol/L) increased(P<0.05),and the Caspase-3 activities of HepG2 cells increased with the increasing mangosteen extract concentration(P<0.05).Conclusion Mangosteen extract can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells.The mechanism may be related to the inhibition of HepG2 cells entrance into S phase and activation of Caspase-3.

Hepatocellular carcinoma,Human hepatocellular carcinoma HepG2 cells,Mangosteen extract,Proliferation,Apoptosis,Cell cycle,Cysteine-containing aspartate-specific proteases-3

廣西醫科大學青年科學基金項目(GXMUYSF09)；實驗室開放課題(02610212063)

賴燕燕(1974～)，女，碩士，講師，研究方向：腫瘤與天然藥物的研究。

李曉龍(1984～)，男，碩士，講師，研究方向：腫瘤及腫瘤治療，E-mail：xlonglee.chn@outlook.com。

R 735.7

A

0253-4304(2016)04-0452-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.04.02

2015-11-16

2016-02-16)