抗體的制備、分離和篩選技術

文│楊明娟（山東省臨朐縣畜牧局）

抗體的制備、分離和篩選技術

文│楊明娟（山東省臨朐縣畜牧局）

抗體主要存在于動物的血清中，是機體免疫系統(tǒng)被特定抗原刺激后，宿主體內的B淋巴細胞通過增殖分化以后形成漿細胞所產生的特定免疫球蛋白，它能夠特異性地結合特定抗原。在血液和淋巴液中，抗原抗體的特異性結合是宿主抵御外來分子和微生物入侵的一種重要機制。經過多年的實際應用，抗體用于治療人和動物的傳染性疫病的效果日益被認可，其良好的應用前景和篩選技術的革新，推動了抗體的制備、分離和篩選技術的迅速發(fā)展。筆者現(xiàn)就相關技術綜述如下。

一、人工制備抗體技術

1.多克隆抗體。當一種抗原侵入宿主的體內時，機體便會誘導免疫系統(tǒng)產生可以中和不同抗原決定簇的抗體。一種天然的抗原通常具有多種不同的抗原決定簇，并且每一個抗原決定簇都能夠刺激細胞產生一種特異性抗體。如果想要把這些抗體按類進行分離，用目前已有的物理、化學或生化方法幾乎不可能做到。

早期制備抗體的放大是將待免疫的動物暴露在抗原條件下，因為抗原物質具有許多不同的抗原決定簇，因此可以產生多種抗體并分泌到血清或者體液中，所以動物血清是包括多種抗體在內的混合物。這種通過體內免疫方法獲得的免疫血清稱為多克隆抗體，也是第一代抗體。但是這種抗體是混合的，對于感染性疾病的臨床治療和抗體分子功能結構的研究無多大幫助。

2.單克隆抗體。毒素或抗原免疫小鼠等模式動物，可刺激模式動物產生特異性的抗體，但產生抗體的漿細胞是終末狀態(tài)的細胞，不能增殖分化，因此產生抗體的能力非常有限且存在時間較短。為了能使B細胞在體外或動物體內無限增殖，科學家采用雜交瘤技術，利用骨髓瘤細胞能夠無限增殖的特點，將產生特異性抗體的B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合，得到既能只分泌一種特異性抗體又可以迅速增殖的雜交瘤細胞。然后將其進行體外培養(yǎng)或者注入小鼠體內，就能得到大量針對某一抗原決定簇的單克隆抗體，由此產生了單克隆抗體制備技術。

1995年，美國的芝加哥大學科學家Katherine Knight從轉基因的兔中分離出了骨髓瘤細胞，從此創(chuàng)立了兔單克隆抗體的制備技術。兔單克隆抗體比鼠單克隆抗體有更加顯著的優(yōu)勢：兔可反復免疫，產生的血清抗體親和力更高、能夠識別更多類型的表位；兔單克隆抗體可以識別出某些小鼠不能識別的抗原；由于兔的脾臟比老鼠大，脾細胞的數量更多，融合試驗中產生雜交瘤細胞的數量更多，結合高通量篩選技術能制備更好的抗體。

單克隆抗體用于治療和診斷疾病的潛力巨大。與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有特異性更強、純度和效價更高、生產成本低等優(yōu)點，應用前景廣闊。單克隆抗體的廣泛應用大幅提高了診斷各種惡性腫瘤和傳染病的準確性。單克隆抗體技術對各種免疫細胞的分離、鑒定以及分類，各種膜表面分子結構和功能的研究，具有深遠的意義。

二、抗體篩選技術

1.噬菌體展示技術。噬菌體展示技術是當前常用的抗體篩選技術，最常用的為溶原性的絲狀噬菌體。這項技術在1985年由美國的Smith博士首次提出，首次證實外源DNA可以插入到絲狀噬菌體基因Ⅲ中，并與pⅢ蛋白融合展示。噬菌體展示技術是將外源DNA片段插入到噬菌體編碼的蛋白基因，使外源基因的表達蛋白可以和噬菌體的外殼蛋白相融合，然后展示在噬菌體的表面。PCR擴增人或動物的抗體庫，以單鏈抗體形式在噬菌體中表達，再以高通量篩選技術進行驗證，獲得抗體的技術可復制性高，應用廣泛。

2.酵母展示技術。酵母（表面）展示技術廣泛應用于蛋白質工程領域。該項技術由KD Wittrup實驗室建立，是分離和改造抗體特異性、親和力和穩(wěn)定性的有力手段。抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)由linker鏈接成單鏈可變區(qū)抗體（scFv單鏈抗體），與酵母表面細胞壁上Aga2p蛋白融合，結合熒光素標記的抗原，以FACS方法分選有結合活性的酵母細胞，然后體外細胞表達抗體，驗證抗體的功能。

3.B細胞永生化。B細胞永生化及活化在單克隆抗體制備方案中對于抗體的獲得至關重要。前期B淋巴細胞永生化的方法是由EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）來介導轉化的，這可以提高細胞的增殖能力和分泌抗體的活性，但缺點是效率低。到2004年，Traggiai等人在研究非典型肺炎冠狀病毒的過程中改進提高了EBV轉化效率的方法。由于來自人的B淋巴細胞資源有限，很難獲得足夠的數量，并且因感染原因、程度和階段的細胞比例不同，所以能夠直接分離純化獲得的B淋巴細胞很少，細胞活性低，能夠分泌目標抗體的能力也比較低。

目前B淋巴細胞永生化技術已經被廣泛應用于單克隆抗體的研究制備和B淋巴細胞的研究。有學者在研究T淋巴細胞、B淋巴細胞的應答過程中也運用了B淋巴細胞永生化技術，并且結合高通量細胞篩選技術，獲得了具有較強增殖能力和抗體分泌活性的記憶B淋巴細胞。

4.單細胞PCR技術。近年來開始廣泛應用單個B細胞抗體制備技術，該技術是一種體外克隆和表達單個抗原特異性B細胞抗體基因的技術，重鏈和輕鏈的可變區(qū)的天然配對會被保留，具有需要的細胞量很少、基因多樣性好、效率高、全人源等優(yōu)點。以噬菌體、細菌和酵母展示為代表的抗體庫技術可以使用天然免疫庫，通過重鏈、輕鏈隨機重組建立抗體序列，通過與抗原多輪富集篩選親和力最強的抗體。天然免疫庫具有多樣性，因此在免疫庫中分離天然配對的抗體更具有優(yōu)勢。

單細胞克隆抗體技術主要應用于漿母細胞和記憶性B細胞的克隆。人的漿母細胞表型清楚，以CD3-/CD19+/CD20-/ CD27++/CD38++/IgM-分選感染后急性期或免疫疫苗者7天后的PBMC，半塊96孔板（約42個細胞孔，H行作為對照）約能克隆出重輕鏈匹配抗體20個。這一方法廣泛應用于流感疫苗、肺炎球菌疫苗和流感感染者、登革熱感染者等突發(fā)傳染病的B細胞克隆中，通過這種技術，目前已經有研究獲得流感、HIV方面研究的中和抗體。另外一種方法是利用特異的抗原蛋白探針，通過組織細胞表達抗原，標記熒光素作為探針分選傳染病感染者恢復期的PBMC，從而分選出抗原探針特異性IgG單個B細胞。例如，Adimab公司利用單細胞PCR技術在兩個月時間里分離出的埃博拉中和抗體比過去20年埃博拉研究領域分離的埃博拉抗體總和還多。