1株具促生作用的氫氧化細菌的分離及鑒定

李忠玲 周曉倫 王衛星 牛李瑩 萬建新 王衛衛

摘要：為了從沙打旺（Astragalus adsurgens Pall.）根際土壤分離具有促生潛力的氫氧化細菌，鑒定其種屬并研究其促生機制，利用連續通氫裝置分離篩選氫氧化細菌，Salkowski比色法測定產吲哚乙酸（IAA）能力，2，4-二硝基苯肼法測定1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶活性，通用CAS平板法檢測鐵載體產生，再結合16S rDNA序列分析和生理生化試驗結果鑒定細菌種屬。結果表明，篩選出1株具有較高促生潛力的氫氧化細菌SDW-16，該菌株具有分泌鐵載體的能力，產IAA的量為21.62 μg/mL，ACC脫氨酶活性為8 694.55 nmol/（mg·h）。結合生理生化和16S rDNA序列（GenBank登錄號：KF835389）分析，鑒定其為熒光假單胞菌。菌株SDW-16具有多項促生特征且均高于或達到了其他報道中相關水平，說明菌株SDW-16有較高的促生潛力和研究價值，同時也初步闡明氫氧化細菌的促生機制。在熒光假單胞菌中發現氫氧化細菌尚屬首次，豐富了人們對氫氧化細菌分類地位的認識。

關鍵詞：氫氧化細菌；鐵載體；IAA；ACC脫氨酶

中圖分類號： Q939.9文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0500-03

E-mail：610253095@qq.com。

通信作者：王衛衛，博士，教授，主要從事豆科植物-根瘤菌共生固氮生態生理學及根際微生物多樣性研究。E-mail：wwwang@nwu.edu.cn。

定植于植物根際、能對植物生長發育產生積極促進作用的細菌稱為植物根際促生菌[1-2]。植物根際促生菌有直接和間接2種方式促進植物生長，直接方式包括固氮作用、產生植物生長激素、分泌鐵載體、溶磷、合成1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶等，間接方式包括產生抗生素、與病原菌競爭根際有限的營養與空間、增強植物抗性等[3]。鑒于植物根際促生菌在農業生產領域的巨大應用潛力，優勢植物根際促生菌的分離鑒定已經成為非常有價值的一項工作。

豆科作物的輪作、間作效益多被歸功于根瘤菌的固氮作用，而已有研究表明，僅有約25%的增產效益與固氮作用相關[4-5]。王瑾等通過對固氮過程中放氫現象和根際微生物群落變化的研究，提出了“氫肥”的概念，即不含吸氫酶（without uptake hydrogenase，HUP-）的根瘤菌在固氮過程中釋放的氫氣能促進根際氫氧化細菌的生長進而促進植物生長[6-7]。氫氧化細菌已被歸類為植物根際促生菌，在農業生產上有廣闊的應用前景，因此開展與其相關的研究工作很有必要。

但是，目前關于氫氧化細菌的研究工作并不充分，雖然以前也有關于氫氧化細菌的研究，但是把氫氧化細菌作為一類植物根際促生菌，并進一步分析其促生特征的研究鮮有報道。本研究利用氣體循環培養體系從豆科植物沙打旺（Astragalus adsurgens Pall.）根際土壤分離氫氧化細菌，從吲哚乙酸（IAA）、鐵載體、ACC脫氨酶等方面探究其促生機制，結合16S rDNA序列分析和生理生化分析確定其分類地位，以期為發現有潛在促生價值的菌株，以及氫氧化細菌的促生機制探究作出一定貢獻。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株SDW-16，筆者所在實驗室從沙打旺根際土壤分離。

1.1.2主要試劑和儀器ACC、D-葡萄糖酸、α-丁酮酸，購自Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產分析純。VIS-7220N可見光分光光度計，購自北京瑞利分析儀器公司。

1.2培養基

MSA培養基參照文獻[8]配制；KingB-Trp培養基參照文獻[9]配制，并添加終濃度為100 mg/L的L-TrP；DF無氮培養基參照文獻[10]配制；DF含氮培養基即在DF培養基中加入3.0 mmol/L ACC；CAS鐵載體檢測培養基參照文獻[11]配制；MKB培養基參照文獻[12]配制。

1.3氫氧化細菌的分離篩選

取10 g土樣轉移到裝有90 mL無菌水的錐形瓶中，置于搖床中，180 r/min、30 min搖勻，吸取0.1 mL上層懸浮液加入0.9 mL無菌水中混勻，進行一系列10倍梯度的稀釋，最終稀釋倍數為10-12。從每個梯度取0.1 mL土壤稀釋液于MSA無機鹽平板培養基上稀釋涂布，每個梯度3個重復。平板倒置于連續通氫裝置（電解水制氫，濃度為0.416～2.42 mmol/L）中，于30 ℃培養14 d。分離的氫氧化細菌進行植物促生試驗，篩選出具有較高促生潛力的氫氧化細菌，進一步研究其促生特性。

1.4促生特征的鑒定

1.4.1吲哚乙酸含量檢測將待測菌株接種于5 mL LB液體培養基中，28 ℃、180 r/min培養24 h，取1.0 mL菌液離心（5 000 r/min、10 min）后棄上清，用無菌水洗滌2次，然后用無菌水稀釋10倍。從上述菌懸液取0.1 mL（約107 CFU）接種到50 mL KingB-Trp（L-Trp終濃度為100 mg/L）培養基，于30 ℃、180 r/min搖床中避光培養72 h。

IAA含量測定根據文獻[13]中的Salkowski比色法。菌株培養液于10 000 r/min離心10 min，取2.0 mL上清液加入避光的凍存管中與2.0 mL Salkowski試劑（1.015 g FeCl3·6H2O，150 mL H2SO4，250 mL ddH2O）混勻，室溫暗處放置 20 min，然后在530 nm波長下測定吸光度。IAA濃度計算參照IAA標準曲線（濃度10～100 μg/mL），每株菌3個重復。

1.4.2ACC脫氨酶活性檢測ACC脫氨酶陽性菌株的篩選根據其能否利用ACC為唯一氮源生長，這被看作細菌具有ACC脫氨酶活性的特征。待測菌株分別接種到DF含氮培養基和DF無氮培養基，于30 ℃培養3 d。無法在DF無氮培養基上生長，但能在添加3.0 mmol/L ACC為唯一氮源的DF含氮培養基上生長的細菌則視為ACC脫氨酶陽性菌株。α-丁酮酸標準曲線的制作及ACC脫氨酶活性的定量測定參照文獻[10]中的2，4-二硝基苯肼比色法，ACC脫氨酶活性以 1 mg 菌體蛋白1 h利用ACC產生的α-丁酮酸的量表示。

1.4.3鐵載體檢測細菌分泌鐵載體的定性檢測參照通用CAS平板法[14]，并加以改進，將檢測培養基分為2層，下層為供細菌生長的MKB無鐵培養基，上層為CAS檢測培養基，細菌在MKB無鐵培養基產生明顯菌落后，將CAS檢測培養基倒入上述平板，放置一段時間后可見平板顏色從藍色變為橘黃色，證明有鐵載體產生，對照為不接菌的檢測平板。

1.5菌株的鑒定

1.5.1細菌形態特征和生理生化特征鑒定細菌的形態和生理生化特征鑒定參照文獻[15-16]中的標準步驟進行。

1.5.216S rDNA序列測定待測菌株送至生工生物工程（上海）服務有限公司進行測序。將得到的16S rDNA序列錄入NCBI網站，與已知的序列比對并分析同源性。用MEGA 5.1軟件和鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統發育樹。

2結果分析

2.1氫氧化細菌的分離純化

根據氫氧化細菌獨特的代謝特點，選取不含碳源的MSA無機鹽培養基分離篩選氫氧化細菌，在H2、CO2、O2組成的混合氣體環境中，只有氫氧化細菌才能利用H2為能源固定CO2為碳源進行化能自養生長。在MSA無機鹽固體平板上于 30 ℃ 培養14 d后，從平板上挑取不同形態的單菌落進一步劃線純化，按照文獻[17]中的TTC試驗法對其進行吸氫酶的定性檢測，得到15株氫氧化細菌，根據促生試驗結果篩選出Pseudomonas fluorescens SDW-16具有較高的促生潛力。

2.2吲哚乙酸含量的檢測

IAA是一種重要的植物激素，在調節植物生長發育中起重要作用，很多植物根際促生菌能分泌IAA對植物生長產生積極的影響。在KingB-Trp培養基中于30 ℃培養72 h后，按上述方法測得菌株SDW-16產生IAA的量為（21.62±0.30） μg/mL。

2.3ACC脫氨酶活性的檢測

3討論

植物根際促生菌能有效促進植物生長，且不會像傳統化學肥料引起環境污染等問題，其在世界上一些地區的實際應用中取得了良好的效果，在農業生產應用中有巨大的潛力，與其相關的研究已得到重視[18]。王瑾等的研究已經證實，氫氧化細菌也屬于一類根際促生菌，而且通過大田試驗和實際農業生產應用證實了氫氧化細菌的促生能力[6]。氫氧化細菌獨特的代謝特點使其成為根際促生菌家族中的獨特種群，豆科植物中有很多是重要的經濟作物，其根瘤附近的富氫環境非常適宜氫氧化細菌生長，因此筆者選擇豆科植物沙打旺根際土壤為研究材料，通過連續通氫裝置模擬豆科植物根際的富氫環境，并利用不含碳源的MSA無機鹽培養基對其進行富集和分離，高促生潛力氫氧化細菌的研究工作對農業增產尤其是豆科作物的增產有廣闊的應用前景。

結合16S rDNA序列及生理生化特征結果進行分析，氫氧化細菌SDW-16 被鑒定為熒光假單胞菌（P. fluorescens），

在熒光假單胞菌中發現氫氧化細菌尚屬首次，這一發現能豐富人們對氫氧化細菌分類地位的認識。熒光假單胞菌是一種重要的植物根際促生菌，SDW-16的促生特征分析很好地印證了這一點，其具有多項植物根際促生菌具備的重要促生特征，尤其是具有很高的ACC脫氨酶活性，植物在干旱、水災、鹽堿等逆境條件中會產生過量乙烯抑制其生長，ACC脫氨酶能裂解乙烯的前體ACC為氨和α-丁酮酸，降低植物體內乙烯水平，減輕對植物生長[JP3]的損害，所以產生ACC脫氨酶是重要的促生機制之一[19]。氫氧化細菌SDW-16的ACC脫氨酶活性高達8 694.55 nmol/（mg·h），遠高于魏素娜等研究中AS[1 116 nmol/（mg·h）、CS （1 002 nmol/（mg·h） ]2株菌[20]；高于Grichko等研究中所有的ACC脫氨酶陽性菌株[21-22]；高于Rashid等研究中68%的ACC脫氨酶陽性株菌，與菌株YsS3[8 580 nmol/（mg·h）]的酶活相當[23]。本研究表明，ACC脫氨酶活性在2 100～5 200 nmol/（mg·h） 之間的菌株能明顯促進番茄和油菜的生長，并顯著增加其抗澇性和耐鹽性[21，24]，而吉云秀等研究中證實PGPR的促生效果與ACC脫氨酶活力呈顯著正相關性[22]，可見就ACC脫氨酶活性而言氫氧化細菌SDW-16有很高的促生潛力。

IAA在植物生長發育過程中起重要作用，微生物包括細菌、真菌也能產生IAA。氫氧化細菌SDW-16產生IAA的量為21.62 μg/mL，達到了較高水平，高于Jalili等研究中全部菌株的產量[24]，高于Tsavkelova等研究中63.6%的IAA陽性菌株[25]，而本研究中添加的Trp終濃度為 200 mg/L。在KingB-Trp培養液中加入IAA的前體物質色氨酸可以促進IAA的產生。IAA含量測定選在菌株培養72 h后，因為此時細菌處于穩定期，培養液中IAA含量最高，IAA見光易分解，所以相關步驟采取避光措施以減少對試驗結果的干擾。

鐵載體是細菌在鐵缺乏環境中分泌的一種對Fe3+有很強特異螯合作用的低分子量化合物，在鐵脅迫環境中鐵載體產生菌可以分泌鐵載體螯合周圍的Fe3+，從而促進自身生長[26]；同時還能抑制病原菌吸收Fe3+，通過抑制病原菌的生長間接促進植物生長。CAS 檢測平板由藍色變為橘黃色表明，菌株SDW-16具有分泌鐵載體的能力。

綜上所述，氫氧化細菌SDW-16具有分泌IAA、產鐵載體和ACC脫氨酶3項重要的促生特征，從已發表文獻中相關菌株的比較來看，其分泌IAA能力和ACC脫氨酶活性均高于或達到相關菌株的水平，說明氫氧化細菌SDW-16有很高的促生潛力和研究價值。氫氧化細菌對植物的促生能力可能與IAA、產鐵載體、ACC脫氨酶有關，后續工作要開展驗證其實際促生效果的研究，如盆栽和田間試驗等，為以后將其作為生產微生物肥料的優質菌種和應用于實際農業生產提供理論依據。

參考文獻：

[1]Ji S H，Gururani M A，Chun S C. Isolation and characterization of plant growth promoting endophytic diazotrophic bacteria from Korean rice cultivars[J]. Microbiological Research，2014，169（1）：83-98.

[2]Ahemad M，Kibret M. Mechanisms and applications of plant growth promoting rhizobacteria：Current perspective[J]. Journal of King Saud University-Science，2014，26（1）：1-20.

[3]Montanez A，Blanco A R，Barlocco C，et al. Characterization of cultivable putative endophytic plant growth promoting bacteria associated with maize cultivars （Zea mays L.） and their inoculation effects in vitro[J]. Applied Soil Ecology，2012，58：21-28.

[4]Maimaiti J，Zhang Y，Yang J，et al. Isolation and characterization of hydrogen-oxidizing bacteria induced following exposure of soil to hydrogen gas and their impact on plant growth[J]. Environmental Microbiology，2007，9（2）：435-444.

[5]McLearn N，Dong Z. Microbial nature of the hydrogen-oxidizing agent in hydrogen-treated soil[J]. Biology Fertility of Soils，2002，35：465-468.

[6]王瑾，王喆之，董忠民. 土壤氫氧化細菌促進作物生長機理研究進展[J]. 應用與環境生物學報，2012，8（5）：853-861.

[7]付博，王衛衛，唐明，等. 一株產1-氨基環丙烷-1-羧酸脫氨酶的氫氧化細菌的分離鑒定及酶活力測定[J]. 微生物學報，2009，49（3）：395-399.

[8]Yu J，Dow A，Pingali S. The energy efficiency of carbon dioxide ？xation by a hydrogen-oxidizing bacterium[J]. International Journal of Hydrogen Energy，2013，38：8683-8690.

[9]李振東，陳秀蓉，李鵬，等. 珠芽蓼內生菌Z5產IAA和抑菌能力測定及其鑒定[J]. 草業學報，2010，19（2）：61-68. [ZK）]

[10]Penrose D M，Glick B R. Methods for isolating and characterizing ACC deaminase-containing plant growth-promoting rhizobacteria[J]. Physiologia Plantarum，2003，118：10-15.

[11]趙翔，陳紹興，謝志雄，等. 高產鐵載體熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens sp-f的篩選鑒定及其鐵載體特性研究[J]. 微生物學通報，2006，33：95-98.

[12]王平，董飚，李阜棣，等. 小麥根圈細菌鐵載體的檢測[J]. 微生物學通報，1994，21（6）：323-326.

[13]Glickman E，Dessaux Y. A critical examination of the specificity of

〖FQ（211。54，ZX，DY-W〗[KH4D]

the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology，1995，61（2）：793-796.

[14]Schwyn B，Neilands J B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores[J]. Aanlytical Biochemistry，1987，160：47-56

[15]沈萍，范秀容，李廣武. 微生物學試驗[M]. 北京：高等教育出版社，2003：26-31.

[16]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001：370-380.

[17]Aragno M，Schlegel H G，Balows A，et al. The mesophilic hydrogen-oxidizing （knallgas） bacteria[M]//Balows A，Trüper H G，Dworkin M，et al. The prokaryotes：a handbook on the biology of bacteria：[JP3]ecophysiology，isolation，identification，applications. Berlin：Springer-Verlag，1992：344-384.

[18]Golding A L，Zou Y，Yang X，et al. Plant growth promoting H2-oxidizing bacteria as seed inoculants for cereal crops[J]. Agricultural Sciences，2012，3（4）：510-516.

[19]Nain M L，Yadav R C，Saxena J. Characterization of multifaceted Bacillus sp. RM-2 for its use as plant growth promoting bioinoculant for crops grown in semi arid deserts[J]. Applied Soil Ecology，2012，59：124-135.

[20]魏素娜，蔣帥，黃錫云，等. 旱地小麥根際細菌中產生1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶菌株的分離和鑒定[J]. 微生物學通報，2011，38（5）：722-728.

[21]Grichko V P，Glick B R. Amelioration of flooding stress by ACC deaminase-containing plant growth-promoting bacteria[J]. Plant physiology and Biochemistry，2001，39：11-17.

[22]吉云秀，黃曉東. 不同鹽分條件下植物促生菌對燕麥和黑麥草幼苗的促生效應[J]. 中國土壤與肥料，2008，2：65-68.

[23]Rashid R，Charles T C，Glick B R. Isolation and characterization of new plant growth-promoting bacterial endophytes[J]. Applied Soil Ecology，2012，61：217-224.

[24]Jalili F，Khavazi K，Pazira E，et al. Isolation and characterization of ACC deaminase producing fluorescent pseudomonads，to alleviate salinity stress on canola （Brassica napus L.） growth[J]. Journal of Plant Physiology，2009，166：667-674.

[25]Tsavkelova E A，Cherdyntseva T A，Botina S G，et al. Bacteria associated with orchid roots and microbial production of auxin[J]. Microbiological Research，2007，162：69-76.

[26]Hu B，Zhao C，Yang S. Influence of iron on siderophore and photosynthetic pigments biosynthesis by siderophore-producing Rhodopesudomonnas palustris[J]. Acta Microbiologica Sinica，2014，54（4）：408-416.