“FQ-PCR溶解曲線法”監(jiān)測麻風患者TCR a鏈CDR 3譜系漂移的研究

張力丹 張慶波 楊小靜 韋蓉 陳利遠 姚新生

“FQ-PCR溶解曲線法”監(jiān)測麻風患者TCR a鏈CDR 3譜系漂移的研究

張力丹1張慶波1楊小靜1韋蓉1陳利遠1姚新生2

麻風病是由麻風桿菌引起的一種慢性接觸性傳染病。主要侵犯人體皮膚和神經(jīng)，如果不治療可引起皮膚、神經(jīng)等永久性的損害。當下，我國對麻風病的治療以預防為主，而對于那些已經(jīng)患上麻風病的患者來說，治療方法還值得更深層次的研究探索。本篇文章的研究方法是通過T細胞受體a鏈V區(qū)基因各家族CDR 3免疫譜系分析技術來監(jiān)測麻風患者TCR a鏈CDR 3譜系的漂移情況，進而初步分析出TRAV家族的CDR 3 PCR產(chǎn)物定量和克隆增生情況，以此為被麻風感染后的患者的T細胞免疫應答變化提供新的研究方向。

CDR 3；FQ-PCR；溶解曲線

T細胞是麻風病發(fā)病的重要參與者，其介導的免疫應答在麻風的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮了關鍵性的作用[1]。本研究利用FQ-PCR 產(chǎn)物的溶解曲線分析原理，對“FQ-PCR溶解曲線法”監(jiān)測麻風患者TCR a鏈CDR3譜系漂移進行研究，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本與試劑

麻風患者外周血10份（由遵義醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院提供），正常健康自愿者外周血4份作為對照。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)Yao XS等[2]中提到的參考文獻的合成方法進行實驗設計，人體TRAV遺傳基因上面存在32條有印物和1條TRAC下游引物，繼而生成對照組TRAC上游引物1條，上述所有引物由 Inviogen 上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2.2 總RNA提取和cDNA合成 根據(jù)實驗對象總體RNA的提取試劑盒說明書進行實驗操作，獲得十例麻風病患者DNA提取物和四例健康志愿者的外周血RNA后，根據(jù)合成條件，用Oligo dT作為引物擴增cDNA。

1.2.3 FQ-PCR擴增TRAV家族a鏈CDR3區(qū)段PCR擴增 將實驗過程中獲得的每個樣品都做出36個PCR的反應試管，試管編號及實驗作用情況如下：第1～34號試驗用試管為實驗樣本試管，第35管為GAPDH對照管，第36管為無引物對照管；對于34個實驗樣品用試管中均加入cDNA 1μl，上、下游引物各1μl，與此同時用熒光定量Mix 10μl，完成熒光劑定量后用純水加入至20μl。FQ-PCR擴增反應條件：一是94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃50 s，45個循環(huán)；94 ℃ 3 min，一個循環(huán)；72 ℃ 10 min，1個循環(huán);二是對實驗樣品的溶解曲線進行分析：從75～95 ℃以0.2 ℃/s讀取一個熒光值，100 cycles；三是FQ-PCR 產(chǎn)物取8 ul，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，剩余樣本-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 CD3 FQPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定

健康志愿者實驗數(shù)據(jù)結(jié)果表明，其外周血標本的32個TRAV家族CDR3譜型FQ-PCR產(chǎn)物在1.5%，而麻風病患者的標本樣品檢測結(jié)果顯示在預測位置處只有一條帶。

2.2 TCR a鏈CDR3譜型

4例健康者PBMC的32個CDR3譜型的FQ-PCR產(chǎn)物均為多峰圖型，無雙峰、偏峰、單峰及無峰家族；麻風患者PBMC的32 個TRAV家族CDR3譜型的FQ-PCR產(chǎn)物各家族相對定量表達不一，PBMC的32個TRAV家族CDR3和對照溶解曲線譜型顯示，部分TRAV家族表現(xiàn)為雙峰、偏峰、單峰圖，極少數(shù)表達頻率極低或消失表現(xiàn)為無峰圖。

3 討論

麻風發(fā)病機制復雜，T細胞在抵抗麻風分枝桿菌的免疫反應中作用重要，多項研究證實T細胞的數(shù)量及功能決定了細胞免疫的強弱，其與麻風的進程密切相關[3-4]，T細胞TCR CDR3譜系偏向性與麻風的進程顯著相關[5]。T淋巴細胞獨特的TCR CDR3分子，形成多樣性的CDR3基因譜型，它在很大程度上決定了人體血液免疫T細胞的功能特點，實驗能夠通過對T細胞中特定CDR3序列的測定，能夠反映出人體免疫T細胞的增殖情況，進而由此增殖狀態(tài)推測出其功能水平。

孫永蘋等學者在文獻研究中指出了TCR CDR3譜系漂移分析技術被廣泛應用于感染性疾病、移植、腫瘤和自身免疫病等[6-7]。本研究的實驗設計方法是利用溶解曲線與FQ-PCR的方法建立了“FQ-PCR溶解曲線法監(jiān)測健康志愿者和患者之間的TCR a鏈CDR3譜系漂移技術”， 在實驗過程中對每個患者TRAV家族的CDR3 FQ-PCR產(chǎn)物進行相對定量分析，監(jiān)測麻風患者外周血樣本TCR CDR3的譜系漂移[8-10]。

本文研究分析了10例麻風患者和4例健康者TRAV各家族的CDR3 譜序，結(jié)果顯示，健康者PBMC的32個TRAV家族溶解曲線圖為多峰，而對照組TRAC、GAPDH為單峰，說明CDR3產(chǎn)物存在多樣性，提示FQ-PCR產(chǎn)物的多態(tài)性可用溶解曲線法進行分析，進而用于研究麻風患者TCR CDR3的譜型特征。而10例麻風患者PBMC的TRAV家族溶解曲線圖為單峰和多峰圖。本實驗的技術和初步數(shù)據(jù)為進一步研究麻風的應答機制和個體化的抗麻風T 細胞治療提供了基礎。

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醫(yī)學論文中統(tǒng)計分析方法的選擇

對于定量資料，應根據(jù)所采用的設計類型、資料所具備的條件和分析目的，選用合適的統(tǒng)計分析方法，不應盲目套用t檢驗和單因素方差分析；對于定性資料，應根據(jù)所采用的設計類型、定性變量的性質(zhì)和頻數(shù)所具備的條件以及分析目的，選用合適的統(tǒng)計分析方法，不應盲目套用χ2檢驗。對于回歸分析，應結(jié)合專業(yè)知識和散布圖，選用合適的回歸類型，不應盲目套用簡單直線回歸分析，對具有重復實驗數(shù)據(jù)的回歸分析資料，不應簡單化處理;對于多因素、多指標資料，要在一元分析的基礎上，盡可能運用多元統(tǒng)計分析方法，以便對因素之間的交互作用和多指標之間的內(nèi)在聯(lián)系作出全面、合理的解釋和評價。

Study on the FQ—PCR Dissolution Curve Method for M onitoring a TCR Chain CDR3 in Leprosy Patients

ZHANG Lidan1ZHANG Qingbo1YANG Xiaojing1WEI Rong1CHEN Liyuan1YAO Xinsheng21 Department of Dermatology, The Second People’s Hospital of Guiyang City, Guiyang Guizhou 550001, China, 2 Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences of Zunyi Medical College, Zunyi Guizhou 563000, China

Leprosy is a chronic infectious diseasecaused by M ycobacterium leprae. Majorviolations of human skin and nerves, if not treatment can cause permanent damage to the skin, nerves, etc. At present, Chinese treatment of leprosy prevention, and for those patients who have been suffering from leprosy, treatment is also worth studying deeper exploration. The research method of this article is through the T cellreceptor gene drift a chain V region each family CDR3 immune pedigree analysis technique to monitor leprosy patient TCR a chain CDR3 pedigree, and preliminary analysis of CDR3 PCR products and TRAVcloning of quantitative hyperplasia of the family, in order to provide a new research direction for T cell immune response changes after the patients infected with leprosy.

CDR3, FQ-PCR, Dissolution curve

R 440

A

1674-9308（2016）35-0045-02

10．3969/j．issn．1674-9308．2016．35．023

1 貴陽市第二人民醫(yī)院皮膚科，貴州 貴陽 550001；2 遵義醫(yī)學院基礎醫(yī)學院免疫學教研室，貴州 遵義 563000