肝細胞肝癌中極性蛋白AF-6mRNA的表達及對侵襲的影響分析

孫鵬宋遠周曉晶

肝細胞肝癌中極性蛋白AF-6mRNA的表達及對侵襲的影響分析

孫鵬1宋遠1周曉晶2

目的 探討肝細胞肝癌中極性蛋白AF-6mRNA的表達及其對侵襲的影響。方法 采用實時定量PCR檢測的方法，對28對癌細胞、ANLT及不同細胞系中的AF-6mRNA表達水平進行檢測，分析AF-6mRNA對侵襲的影響。結果 26例肝細胞肝癌中AF-6mRNA呈現低表達，發生率為92.9%；肝癌細胞株中AF-6mRNA表達低于正常桿細胞株（P＜0.05）；低侵襲轉移能力細胞系中AF-6mRNA表達高于高侵襲轉移能力細胞系（P＜0.05）。結論 肝細胞肝癌中AF-6mRNA低表達可能與高侵襲能力有關。

肝細胞肝癌；AF-6mRNA；侵襲

肝細胞癌術后復發轉移率較高，會影響患者預后。當前，臨床上尚未尋找到有效的方法，對術后復發轉移進行控制[1]。AF-6是一種極性蛋白，為細胞緊密連接的成分[2]。有研究認為，在胰腺癌的侵襲轉移中，AF-6mRNA發揮著重要的作用[3]。但臨床上針對其在肝細胞肝癌中的表達及侵襲轉移中影響的研究仍較少[4]。基于此，本研究檢測了癌細胞、ANLT及不同細胞系中的AF-6mRNA表達水平，分析其對侵襲轉移的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2015年6月～2016年6月本院收治的28對肝細胞肝癌患者的肝癌組織及癌旁組織標本。28例標本中，男20例，女8例；患者平均年齡（45.3±2.4）歲，平均腫塊大小（3.1±0.9）cm。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 購自上海生命技術科學院的正常肝細胞株L02、肝癌HepG2、HCCLM3等；購自羅氏公司的Faststart Universal SYBRGreen Master瑞士試劑盒；購自Gibco公司的Taq DNA聚合酶等。

1.2.2 培養細胞系 分別復蘇、培養、傳代并凍存人肝L02細胞及肝癌HepG2、HCCLM3等。

1.2.3 提取肝癌組織標本及細胞株總RNA 將1.0 ml裂解液溶入研磨好的新鮮肝癌及ANLT標本中，以移液器進行吹打；將0.2 ml氯仿溶入，進行15 s劇烈震蕩，靜置3 min。做10 000 r離心處理，持續15 min。在新管中轉移上層水相，溶入0.5 ml異丙醇沉淀RNA，靜置10 min；做10 000 r離心處理，持續10 min，將上清液移去，將100 μl無RNA酶水溶入，充分溶解后，置入零下80℃冰箱中保存。

1.2.4 定量PCR檢測 按照GeneBank數據庫中人AF-6基因的序列，內參為人GAPDH，交由上海生工生物技術公司合成，嚴格按照試劑盒使用說明書進行操作。PCR反應：95℃預變性，持續10 min；95℃變性，持續15 s；60℃退火，持續60 s；72℃延伸，持續30 s，持續40個循環。

1.3 統計學分析

以SPSS 19.0軟件進行統計分析，數據滿足正態且方差齊性時，以獨立樣本t檢驗；數據滿足正態但方差不齊時，以校正t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 AF-6mRNA在肝癌組織中的表達

本組28對組織標本中，26例肝細胞肝癌中AF-6mRNA呈現低表達，發生率為92.9%。

2.2 不同細胞株中AF-6mRNA表達水平

設正常肝細胞株L02相對表達量為1。肝癌HepG2、HCCLM3、MHCC97-H的AF-6mRNA表達分別為（0.6±0.1）、（0.2±0.1）、（0.3±0.1），均低于正常桿細胞株，差異有統計學 意 義（t=25.298、50.596、44.272，P=0.000、0.000、0.000）；低侵襲轉移能力細胞系肝癌HepG2中AF-6mRNA表達高于高侵襲轉移能力細胞系HCCLM3、MHCC97-H，差異有統計學意義（t=17.889、13.416，P=0.000、0.000）。

3 討論

僅有部分早期確診的肝癌患者能及時進行手術治療，延長生存時間，但整體上病死率仍居高不下[5]。影響肝癌患者預后的關鍵，

是較高的術后復發轉移率。這就需要尋找肝細胞肝癌患者術后潛在復發轉移分子機制。

AF-6為極性蛋白，在維持細胞發育、修復損傷、保持組織完整性中發揮著重要的作用，且在卵巢癌、乳腺癌、白血病等多種癌癥中存在異常表達[6]。有研究認為，在腫瘤的發生與發展過程中，極性蛋白的異常表達及錯誤定位具有重要意義[7]。但是，臨床上仍缺乏對肝細胞肝癌中AF-6mRNA表達及其對侵襲影響的研究[8]。

本研究中，26例肝細胞肝癌中AF-6mRNA呈現低表達。提示在肝癌的發生與發展過程中，AF-6mRNA可能發揮著一定的作用。此外，肝癌HepG2、HCCLM3、MHCC97-H肝癌細胞株中AF-6mRNA表達低于正常桿細胞株（P＜0.05）。而且，低侵襲轉移能力細胞系肝癌HepG2中AF-6mRNA表達高于高侵襲轉移能力細胞系HCCLM3、MHCC97-H（P＜0.05）。由此可知，AF-6mRNA表達的變化可能與肝癌的侵襲轉移有一定的相關性。此外，在肝細胞肝癌組織及細胞中，AF-6mRNA呈現低表達。因此AF-6mRNA表達的變化可能與肝癌的侵襲轉移呈現負相關，提示AF-6可能會抑制肝細胞肝癌侵襲轉移。

綜上所述，肝細胞肝癌中AF-6mRNA低表達可能與高侵襲能力有關，今后可能發展成為分子、基因水平治療肝細胞肝癌的潛在靶點，需引起高度關注。

[1] 吳天春，馮留順，李捷，等. 極性蛋白AF-6mRNA在肝細胞肝癌中的表達及其對侵襲的影響[J]. 世界華人消化雜志，2015，23（31）：5045-5049.

[2] 陳志平. MiR-573/apoM/Bcl2A1途徑對肝細胞凋亡和肝癌形成影響及其機制研究[D]. 廣州：南方醫科大學，2015：34-35.

[3] 李慶軍. miR-10b通過抑制CADM1表達促進人肝細胞肝癌細胞侵襲和轉移的機制研究[D]. 西安：第四軍醫大學，2013：15-16.

[4] 徐智，陽書華，王愷，等. 不同轉移潛能肝癌細胞株GRP78的表達及其對肝癌細胞生物學行為的影響[J]. 中國病理生理雜志，2011，27（1）：108-112.

[5] 陳宏輝，彭蕾. 全反式維甲酸對肝癌細胞HepG2的分化、侵襲遷移的影響[J]. 世界華人消化雜志，2011，19（33）：3381-3389.

[6] 常遠鴻，李汀，陰俊，等. 靶向沉默CXCR4基因抑制肝細胞癌侵襲體外研究[J]. 中華腫瘤防治雜志，2013，20（20）：1569-1573，1579.

[7] 周亮. Notch信號通路參與肝癌細胞侵襲遷移的機制研究[D]. 西安：第四軍醫大學，2013：12-13.

[8] 蔣成英. GA6與SHP2蛋白在肝細胞癌中的臨床意義及其作用機制的研究[D]. 天津：南開大學，2012：8-9.

Expression of Polar Protein AF-6mRNA in Hepatocellular Carcinoma and Its Effect on Invasion

SUN Peng1SONG Yuan1ZHOU Xiaojing21Department of Gastroenterology, Jilin Provincial People’s Hospital, Changchun Jilin 130021, China, 2 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Basic Medical College, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun Jilin 130017, China

Objective To investigate the expression of AF-6mRNA protein and its effect on the invasion of hepatocellular carcinoma. Methods Using real-time quantitative PCR detection method, the expression levels of AF-6mRNA in 28 pairs of cancer cells, ANLT and cell lines were detected, and the influence of AF-6mRNA on the invasion was analyzed. Results 26 cases of AF-6mRNA showed low expression in hepatocellular carcinoma, the incidence rate was 92.9%, the rod was significantly lower than the normal cell line AF-6mRNA expression in hepatocellular carcinoma cell line (P＜0.05), was obviously higher than that of invasion and metastasis of AF-6mRNA cells expressing ability in cell lines with low metastasis (P＜0.05). Conclusion Low expression of AF-6mRNA in hepatocellular carcinoma may be related to high invasive ability.

Hepatocellular carcinoma, AF-6Mrna, Attack

R735

A

1674-9308（2016）33-0237-02

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.33.137

吉林省衛生計生科研計劃課題（20152084）

基金項目：吉林省衛生計生自籌經費課題（2015s2c06）

1 吉林省人民醫院消化內科，吉林 長春 130021；2 長春中醫藥大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，吉林 長春 130017

周曉晶，E-mail：589632478@qq.com